CN119506218A 哺乳类细胞株及其用于制造猪瘟病毒可溶性e2重组抗原的方法及其应用 （台湾屏东科技大学）

DSMACC33762023.05.17哺乳类细胞株及其用于制造猪瘟病毒可溶本发明公开了一种哺乳类细胞株及其用于制造猪瘟病毒可溶性E2重组抗原的方法及其应大量表达可溶性CSFV_E2重组蛋白，有效降低生2达猪瘟病毒可溶性E2重组抗原的哺乳类细胞株为于2023年05月17日寄存于德国菌种保藏号为DSMACC3376的中国仓鼠上皮细胞株(ChineseHamsterOvarycell)CCC2.根据权利要求1所述的稳定表达猪瘟病毒可溶性E2重组抗原的哺乳类细胞株，其特3.根据权利要求1所述的稳定表达猪瘟病毒可溶性E2重组抗原的哺乳类细胞株，其特4.根据权利要求1所述的稳定表达猪瘟病毒可溶性E2重组抗原的哺乳类细胞株，其特5.根据权利要求1所述的稳定表达猪瘟病毒可溶性E2重组抗原的哺乳类细胞株，其特征在于，其中该可溶性E2重组蛋白的蛋白浓度为850mg/L细胞培养液至950mg/L细胞培养6.根据权利要求1所述的稳定表达猪瘟病毒可溶性E2重组抗原的哺乳类细胞株，其特7.一种猪瘟病毒可溶性E2重组蛋白的制造方可溶性E2重组蛋白的蛋白浓度为至少800m9.一种猪瘟病毒可溶性E2重组抗原，其特征在于，该据权利要求1所述的哺乳类细胞株所制造，其中该可溶性E2重组蛋白的一氨基酸序列为如9所述的猪瘟病毒可溶性E2重组抗原做为一有效成分，且该猪用次单位疫苗组成物对一受3组抗原的哺乳类细胞株及其用于制造猪瘟病毒可溶性E2重组抗原的方病毒科(Flavivirdae)瘟疫病毒属(Pestivirus)。CSFV基因组为单股正向的RNA，全长约4MikroorganismenundZellkulturenGmbH，DSMZ；地址为Inhoffenstraβe7B，国仓鼠上皮细胞株(ChineseHamsterOvarycell)CCC_E2_5E1[0012]在上述实施例中，前述可溶性E2重组蛋白的氨基酸序列可例如为如序列识别号[0013]在上述实施例中，前述可溶性E2重组蛋白的蛋白浓度可例如为至少800mg/L细胞液。在另一些例示中，前述可溶性E2重组蛋白的蛋白浓度可例如为850mg/L细胞培养液至乳类细胞株所制造，其中可溶性E2重组蛋白的氨基酸序列可例如为如序列识别号(SEQID可利用不同细胞代数的哺乳类细胞表达系统大幅提升猪瘟病毒可溶性E2重组抗原的产量，[0022]图1A及图1B分别显示根据本发明一实施例的转染CHO细胞培养液的SDS_PAGE的胶[0023]图2A至图2B分别显示根据本发明一实施例的CHO细胞株CCC_E2_5E12表达的E2重[0024]图3A至图3B分别显示根据本发明一实施例的不同细胞代数的CHO细胞株CCC_E2_55E12于细胞液中表达E2重组蛋白在纯化前的SDS_PAGE的胶体影像(图3A)与免疫印迹法(图[0025]图4A至图4B分别显示根据本发明一实施例的不同细胞代数的CHO细胞株CCC_E2_5E12于细胞液中表达的E2重组蛋白在纯化后的SDS_PAGE的胶体影像(图4A)与免疫印迹法[0026]图5显示根据本发明一实施例的不同细胞代数的CHO细胞株CCC_E2_5E12的细胞液重组抗原由哺乳类细胞表达系统生产可溶性猪瘟病毒E2(C[0034]此处所称的「E2重组蛋白」可例如为全长的E2重组蛋白，开的猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus)2.1a基因亚型的基因序列(GenBank编号：6性添加人鼻病毒3C蛋白酶(humanrhinovirus3Cprotease；HRV3Cprotease)切割位点德國微生物菌種保存中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH，DSMZ；地址为Inhoffenstraβe7B，38124Braunschweig，德国)、寄存编号为DSMACC3376的中国仓鼠上皮细胞株(ChineseHamsterOvarycell)CCC_E2_5E12、分类命毒可溶性E2重组抗原的产量，其中CSFV_E2重组蛋白的生产量在每公升细胞培养液中可得7[0040]上述可溶性CSFV_E2重组蛋白可与其他抗原蛋白组成双价或多价抗原，且仅须单[0041]在一些实施例中，上述猪用次单位疫苗组成物的CSFV_E2重组蛋白的有效剂量可开的猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus)2.1a基因亚型的基因序列(GenBank编号：达系统，产品型号A29129，ThermoFisherScientific)，根据Thermo公司的操作手册[0049]利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis，SDS_PAGE)胶体电泳及蛋白质转移(Transfer)的[0050]请参阅图1A及图1B，其分别显示根据本发明一实施例的转染CHO细胞培养液的8SDS_PAGE的胶体影像(图1A)与免[0053]申言之，将细胞连续稀释到1000细胞/mL的细胞浓度后，取0.1mL的细胞液加上达猪瘟病毒可溶性E2重组抗原的哺乳类细胞株)，寄存于德国菌种保藏中心(Deutsche7B，38124Braunschweig，德国)，名称为中国仓鼠上皮细胞株(ChineseHamsterOvary缓冲液A[含有50mM三羟甲基氨基甲烷(Tris)及500mM氯化钠(NaCl)]回溶，其酸碱值为pH[0057]利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis，SDS_PAGE)胶体电泳及蛋白质转移(Transfer)的免疫印迹法(Westernblot)分析第2.1节纯化所得的重组蛋白，其结果如图2A(SDS_PAGE：[0058]将上述含有E2重组蛋白的SDS_PAGE胶片转印到聚偏二氟乙烯(polyvinylidenedifluoride，PVDF)膜(GEhealthcare，进阶)上，与20mL的阻隔缓冲溶液[blockingbuffer，含有聚山梨醇酯20(Tween20)的Tris缓冲盐溶液(TrisBufferedSalinewith1000的抗体与TBST缓冲溶液(添加0.1％Tween_20的1xPBS)]在4℃反应16至18小时。之9然后，将PVDF膜与抗_小鼠抗体(anti_mousean[0060]图2A的结果显示，CHO细胞株CCC_E2_5E12的上清液确实可纯化出CSFV_E2重组蛋[0062]为了确认不同细胞代数的CHO细胞株CCC_E2_5E12的CSFVE2重组蛋白的表达量是[0063]请参阅图3A至图3B，其分别显示根据本发明一实施例的不同细胞代数的CHO细胞株CCC_E2_5E12于细胞液中表达E2重组蛋白在纯化前的SDS_PAGE的胶体影像(图3A)与免疫前，E2重组蛋白确实能稳定表达于上清液中，如图3A及图3B的箭头301所指的色带信号相[0065]请参阅图4A至图4B，其分别显示根据本发明一实施例的不同细胞代数的CHO细胞株CCC_E2_5E12于细胞液中表达的E2重组蛋白在纯化后的SDS_PAGE的胶体影像(图4A)与免[0068]请参阅图5，其显示根据本发明一实施例的不同细胞代数的CHO细胞株CCC_E2_CHO细胞株CCC_E2_5E12的上清液在纯化后，不同细胞代数的CHO细胞株的E2重组蛋白表达少800mg/L细胞培养液，较佳为至少850mg/L细胞培养液，更佳为850mg/L细胞培养液至[0072]虽然本发明已以数个特定实施例揭露如上，但可对前述揭露内容进行各种润饰、[0077]中国仓鼠上皮细胞株(ChineseHamsterOvarycell)CCC_E2_5E12寄存于德国菌种保藏中心(Deutsche