CN119506360A 一种向植物中导入目标dna片段的方法及其应用 （深圳华大生命科学研究院）

一种向植物中导入目标DNA片段的方法及其本发明提供了一种向植物中导入目标DNA片因组中包含所述目标DNA片段的小立碗藓原生质入所述目标DNA片段。本发明通过前期的条件摸较好地实现细胞融合及后续融合培养物的稳定标DNA片段的转移，有望在植物基因组合成和植2组中包含所述目标DNA片段的小立碗藓原生质体与所述植物的原生质体进行电融合，实现分别制备所述小立碗藓和所述植物的原生质将所述混合细胞液加入融合电极进行电融合，将电融合后的原生L甘露醇和0.05_0.15mmol/水稻中任一项。10.权利要求1_9中任一项所述的向植物中导入目标DNA片段的方法在植物基因转化中3[0001]本发明属于细胞融合技术领域，具体涉及一种向植物中导入目标DNA片段的方法[0002]细胞融合技术是20世纪60年代发展起来的一项新兴细胞工程技术。细胞融合前植物转化常用的方法为农杆菌介导的遗传转化，利用不同的克隆载体可实现小于100kb一种向植物细胞中导入DNA片段的新方法[0007]针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种向植物中导入目标DNA片藓和植物融合实现DNA片段的转移，有望在植物基因组合成和植物定制化改造研究等应用核基因组中包含所述目标DNA片段的小立碗藓原生质体与所述植物的原生质体进行电融4[0012]目前涉及到细胞融合的基础研究或者生产投入大多数是基于同类细胞或者同种0.6mol/L、0.7mol/L或0.8mol/L等；CaCl2的浓度为0.05_0.15mmol/L，例如可以是5_22mMMES(例如可以是[0037]第二方面，本发明提供第一方面所述的向植物中导入目标DNA片段的方法在植物[0041](2)虽然细胞融合不受种属的界限，但不同生物体细胞之间的融合仍具有较高的6[0058]实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文[0063]在灭菌的小圆形培养皿中加入5mLT3酶解液(Test3：1％Cellulase，0.2%悬原生质体；取20μL悬浮液加到细胞计数器中对原生质体进行计数(显微镜：OLYMPUS，7[0064]在灭菌的50mL离心管中加入25mL质量百分比为2％崩溃酶；取4皿小立碗藓(野生0.6mol/L甘露醇溶液悬浮原生质体，用40μm滤网再次过滤；用0.6mol/L甘露醇溶液加至[0066]利用拟南芥愈伤组织(无叶绿体)带有的绿色荧光和野生型小立碗藓(无荧光)带[0068]本实施例提供了一种小立碗藓原丝体和拟南芥愈伤组织小立碗藓原生质体和拟南芥原生质体的制备方法参照实施例1，电场诱导融合的步骤和参PIM液体培养基的6孔细胞培养皿中，重复操作至电融合200μL细胞液(注意设置对照)，20[0070]利用拟南芥愈伤组织(无叶绿体)带有的绿色荧光和野生型小立碗藓(无荧光)带8[0072]本实施例提供了一种小立碗藓原丝体和拟南芥愈伤组织小立碗藓原生质体和拟南芥原生质体的制备方法参照实施例1，电场诱导融合的步骤和参PIM液体培养基的6孔细胞培养皿中，重复操作至电融合200μL细胞液(注意设置对照)，20[0074]融合效果：利用拟南芥愈伤组织(无叶绿体)带有的绿色荧光和野生型小立碗藓且能在GFP荧光通道下观察到带有叶绿体的绿色荧光细胞(融合细胞)(显微镜：OLYMPUS，[0077]本实施例构建了携带mCherry红色荧光蛋白的拟南芥(图7)和携带GFP绿色荧光蛋[0081]本实施例提供了一种小立碗藓原丝体和拟南芥愈伤组织[0082]在灭菌的小圆形培养皿中加入5mLT3酶解液(Test3：1.2％Cellulase，0.2%悬原生质体；取20μL悬浮液加到细胞计数器中对原生质体进行计数(显微镜：OLYMPUS，9[0086]融合效果：利用拟南芥愈伤组织(无叶绿体)带有的绿色荧光和野生型小立碗藓态异常，在GFP荧光通道下观察到极少带有叶绿体的绿色荧光细胞(融合细胞)(显微镜：[0089]本对比例提供了一种小立碗藓原丝体和拟南芥愈伤组织小立碗藓原生质体和拟南芥原生质体的制备方法参照实施例1，电场诱导融合的步骤和参PIM液体培养基的6孔细胞培养皿中，重复操作至电融合200μL细胞液(注意设置对照)，20[0091]融合效果：利用拟南芥愈伤组织(无叶绿体)带有的绿色荧光和野生型小立碗藓GFP荧光通道下未能观察到带有叶绿体的绿色荧光细胞(融合细胞)(显微镜：OLYMPUS，[0098]经过融合后，在GFP荧光通道下未能观察到带有叶绿体的绿色荧光细胞(融合细露醇浓度在0.5_0.8mol/L之外或者CaCl2的浓度在0.05_0.15mmol/L之外，电融合效果较察到融合细胞，后续的细胞再生培养可形成细胞团，并且细胞状态正常。相比聚乙二醇(PEG)诱导融合法提高了细胞之间的融合效率。本发明建立的小立碗藓和拟南芥细胞融合