DB43∕T 953-2014 茄科蔬菜病毒病绿色防控技术操作

ICS65.020.20茄科蔬菜病毒病绿色防控技术操作规程Regulationforgreenpreventioncontroltechnologyofthesolanaceaevegetablevirusdiseases2014-10-21发布2014-11-20实施湖南省质量技术监督局发布I Ⅱ 1 13术语和定义 14发生流行规律 1 24.2虫传病毒病流行规律 2 2 25.2生物学检测 2 25.4分子生物学检测 2 27防治方法 3 3 3 4 4 5 5 5附录A(资料性附录)茄科蔬菜病毒病症状 6附录B(规范性附录)病毒病生物学、 7附录C(规范性附录)农药防治传毒害虫及病毒病一览表 附录D(资料性附录)茄科蔬菜病毒病防治档案 Ⅱ本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由湖南省植物保护研究所提出。本标准由湖南省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：湖南省植物保护研究所。本标准主要起草人：刘勇、张德咏、张卓、黄志龙、谭新球、文吉辉、孙淑娥、张宇、罗路云。DB43/T953—20141茄科蔬菜病毒病绿色防控技术操作规程本标准规定了茄科蔬菜病毒病的术语和定义、发生流行规律、病害诊断、防治原则、防治方法、统防统治、防治档案等技术要求。本标准适用于辣椒、番茄、茄子等茄科蔬菜病毒病的绿色防控。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB4285农药安全使用标准GB8321农药合理使用准则GB16715.3瓜菜作物种子茄果类NY/T393绿色食品农药使用准则3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1绿色防控技术Greencontroltechnical绿色防控是基于“预防为主、综合防治”的植保方针和“公共植保、绿色植保”的植保理念，以确保农业生产、农产品质量和农业生态环境安全为目标，以减少农药使用为目的，优先采取生态调控、生物防治、物理防治和科学用药等资源节约型、环境友好型技术来控制农作物病虫害的植物保护措施。3.2茄科蔬菜Solanaceaevegetables茄科蔬菜主要包括辣椒、番茄、茄子等蔬菜。3.3即由植物病毒侵染引起的病害，具有寄生性、专一性或广谱性等。植物病原病毒一般活体寄生，但某些病毒亦可在发病植株残体中长期存活；病毒在植物体内进行核酸(RNA或DNA)和蛋白外壳复制并组成新病毒粒子，粒子在植物维管束中迅速移动致使植物周身感染并发病。4发生流行规律在湖南茄科蔬菜病毒病主要由黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒引起。病毒病的发生除自身带毒外，还与带毒害虫的传播有关。病毒病由液汁接触和传毒害虫传播为主。2DB43/T953—20144.1接触传染病毒病流行规律在茄科蔬菜生产中进行整枝，打叉，搭架，采果等农事活动，只要造成寄主微创口，即可侵入危害，病毒可在多种植物上越冬，病残体、带毒种子均可成为病毒病的初侵染源，此外，土壤瘠薄、黏重、板结、排水不良和偏施氮肥都会加重病情发展。4.2虫传病毒病流行规律黄瓜花叶病毒和烟草花叶病毒主要通过蚜虫和烟粉虱等介体传播，在温室大棚内，由于常年温度比较高适合蚜虫和烟粉虱生长繁殖，导致病毒病常年发生；在湖南地区无设施栽培的田块，茄科蔬菜一般在4月初进行大田定植，由于温度较低，不适合蚜虫、烟粉虱生长、繁殖，田间未见通过虫传病毒病植株；田间虫传病毒病植株开始于5月底6月初，刚开始发病时田间有少量的蚜虫、烟粉虱，随着温度的上升降雨量减少，特别是8月～9月的高温干旱天气，适合蚜虫、烟粉虱的生长、发育和繁殖，田间出现了大量的蚜虫、烟粉虱，随着蚜虫和烟粉虱的迁移，田间茄科蔬菜大面积的发生病毒病，严重的影响了茄科蔬菜的生产，甚至导致植株落花、落果、落叶后死亡。预防蚜虫、烟粉虱等害虫的发生对防治病毒病的很重要。5病窖诊断5.1病害田间诊断茄科蔬菜病毒病的危害症状有三种表现症状：叶片出现浓绿和淡绿色相同的花斑，幼苗表现矮缩，新叶略曲扭，成株不矮缩，新叶表现花叶，称为花叶型。有的叶片狭长呈线状，色淡卷曲，节间缩短，称为蘸叶型。有的在叶、叶柄及茎上出现红褐色至黑褐色坏死条斑，病茎易折断，病果有坏死斑和畸形，称条纹型(参见附录A图A1、A2)。5.2生物学检测用于生物学检测病毒的常用鉴别寄主植物有心叶烟、三生烟、本氏烟、苋色藜、黄瓜、蚕豆等。采用摩擦接种的方法对病毒进行接种培养。具体方法和检测结果见附录B.15.3血清学检测(Dot-ELISA检测)在进行生物学检测的同时也使用血清学的方法对所采样品进行检测。具体方法和检测结果见附录B.2.5.4分子生物学检测采用硅粒吸附法提取植物总RNA。以硅粒吸附法提取的总RNA为模板，选取随机引物进行反转录 (RT),转录合成cDNA链，电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，使用Alpha凝胶成像系统观察并拍照记录。扩增片段与预期目标条带大小一致，则为阳性样品，表明植物叶片中携带该病毒见附录B.3。根据茄科蔬菜病毒病和传毒害虫的发生规律及危害特点，本着“预防为主，综合防治”的指导思想，从农田生态系统整体出发，保护生物多样性，控制生产环境，减少病毒来源，具体以农业防治、物理防治、生物防治为主，选用抗病品种、种子脱毒、培育无毒种苗、清洁田园、减少田间寄主的存在等措施，34田块7d左右再定植。小行高畦，行与行之间挖一条深(10～15)cm,宽(15～20)cm的沟，以利于排水。DB43/T953—201457.4.2田间释放天敌控制传毒害虫田间释放瓢虫、草蛉等捕食性天敌和丽蚜小蜂等寄生性天敌防治蚜虫、蓟马、烟粉虱等传毒害虫。7.4.3生防菌防控利用蚜霉菌、蜡蚜轮枝菌、1.8%阿维菌素乳油、木霉菌等生防菌株防治传毒害虫。7.5农药防治在上述措施无法控制在病毒病和传毒害虫经济阀值以下，且病毒病和传毒害虫出现大面积爆发时，采用农药防治。农药使用应符合国家绿色食品农药使用准则。7.5.1病毒病农药防治采用高效、低毒、低残留农药防治病毒病，防治病毒病常用药剂的用量及用法见附录C。7.5.2主要传毒害虫防治通过切断传毒介体的传播途径，来控制茄科类蔬菜病毒病发生具有重要作用。蔬菜定植后(1~3)d,将25%噻虫嗪水分散粒剂稀释(1000～1500)倍液按每株50ml灌根处理，对传毒害虫进行预防。根据田间虫情，当有虫株率达到影响经济阀值时开始用药，选用高效、低毒、低残留农药防治，农药应交替使用，同一药剂不得连续施用2次；茄科蔬菜病毒病主要传毒介体有蚜虫、烟粉虱等害虫。a)蚜虫农药防治当田间有虫率(5～15)%时开始用药，优先采用植物源农药，防治蚜虫常用药剂的用量及用法见附录C。b)烟粉虱农药防治当田间有虫率(10～15)%时开始用药，优先采用植物源农药，防治烟粉虱常用药剂的用量及用法见附录C。8深化病虫测报，确保统防统治根据田间调查情况结合气象因素分析，及时对病虫害进行预测预报，当病虫害达到影响经济阀值时，当地政府应组织种植户对整片作物进行科学的病虫害防治。9建立防治档案建立茄科蔬菜病毒病防治档案，具体档案记录表格见附录D。DB43/T953—20146附录A(资料性附录)茄科蔬菜病毒病症状茄科蔬菜病毒病的危害症状有三种表现症状：叶片出现浓绿和淡绿色相同的花斑，幼苗表现矮缩，新叶略歪扭，成株不矮缩，新叶表现花斑，称为花叶型。有的叶片狭长呈线状，色淡卷曲，节间缩短，称为蘸叶型。有的在叶、叶柄及茎上出现红褐色至黑褐色坏死条斑，病茎易折断，病果有坏死斑和畸形，称条纹型见图A1、图A2。图A1辣椒病毒病为害症状图A2番茄病毒病为害症状DB43/T953—20147(规范性附录)病毒病生物学、血清、分子生物学检测B.1病毒生物学检测B.1.1病毒摩擦接种方法将少许感染病毒的病叶，放于研钵，加入适量接种缓冲液，充分研磨。用喷粉器将金刚砂(200~400)目撒到待接种叶的表面(也可直接将金刚砂加在研磨液中),在营养钵内插上标签，注明处理及时间；用手指或研棒、棉球和纱布蘸取少许汁液，在待接种叶面上轻轻均匀地涂擦，沿一个方向抹，一般沿从叶基到叶尖方向，涂擦时用另一只手指托住叶片，注意用手涂擦前需用肥皂洗净手指；用清水冲洗接过种的叶片，将植株放于温室(最好22～25℃)。用缓冲液接种植株作对照；接种后的纯化，将带毒叶片用接种缓冲液研磨后采用摩擦汁液接种的方法接种于枯斑寄主上，待枯斑寄主表现单斑后，将单个斑点剪下，用接种缓冲液研磨再次接种至枯斑寄主，出现单斑症状后再次取下单斑接种于枯斑寄主，出现斑点后再取单个斑点接种于系统寄主，出现系统症状后再取叶片进行保存和检测。B.1.2病毒的保存将经过三次单斑纯化后毒源，再次接种至系统寄主上，待其出现系统症状后，取发病叶片使用冷冻干燥的方法处理后，写明标签，存于-80℃冰箱。将经分离纯化后得到的不同病毒的病毒分离物分别接种至病毒敏感植物上，判断其致病力的强弱(见图B1、图B2)。图B1CMV分离物接种至苋色藜上的症状(a):枯斑；接种至心叶烟上的症状(b):系统花叶。图B2TMV分离物接种至心叶烟上的症状(a):枯斑；接种至三生烟上的症状(b):系统花叶。DB43/T953—20148植物叶片称重后，按重量体积比1:10～1:50(g/ml)加入0.01mol/LPBS研磨；8000rpm离心3min;取2u1上清点到硝酸纤维素膜(NC膜);室温干燥10min;NC膜浸入到含5%脱脂奶粉室温封闭30min;NC膜放入5%的脱脂奶粉1:5000倍稀释的单抗中室温孵育(30～60)min;PBST洗膜(3～4)次，每次3min;NC膜放入用5%的脱脂奶粉1:8000倍稀释的碱性磷酸酶标记羊抗鼠IgG二抗wholemolecule中室温孵育(30～60)min;PBST洗膜(4～5)次，每次5min;最后一遍再用PBS洗5min。显色底物眼观察并记录结果见图B3。L.L.Jji潮B.3.1GB溶液配方4.0M0.2M25mM2.5%(W/V)异硫氰酸胍NaAc(pH5.2)EDTA(pH8.0)KAcPVP-40B.3.2模板RNA的制备加100μLNLS,70℃温育10min,不时上下颠倒混匀，冰上放置5min,13000/min离心10min;取300 离心1min,倒去上清；加500μL洗涤液(WB:无水乙醇=1:1)洗涤，6000/min离心1min,倒掉上清，离心3min,取上清，-20℃保存。B.3.3RT-PCR扩增B.3.3.1反转录转录合成cDNA链具体反应体系及步骤见表B.1。9DB43/T953—20试剂体积TotalRNARandomPrimer2×TSReactionMixRIEnzymeMixgDNARemover上述混合液25℃孵育10min,42℃孵育30min,85℃加病毒名称(前引/后引)引物序列片段长度CMVCP-F:ATGGACAAATCTGRATCWMCC476bpCP-R:CTGGATGGACAACCCGTTCTMVTob-Uni1ATTTAAGTGGASGGAAAAVCACT570bpTMVspecCGGTCAGTGCCGAACAAGAA(K=G或T;W=A或T;V=A,C或G;S=G或C;Y=C或T;R=A或G;B=G,C或T)试剂体积10×Buffer2.5mMdNTP前引后引酶cDNA加水定容至20μL表B.4CMV、TMV的特异性RT-PCR反应程序病毒名称94℃预变性4min,94℃,45s:55℃,45s:72℃,1min,35个循环；72℃延伸7min.DB43/T953—2014B.3.4琼脂糖凝胶电泳1%琼脂糖凝胶电泳检测，取5HL扩增反应物与2mLSYBRGreen染料、3mLloadingbuffer混匀，点入样孔内。电泳缓冲液1×TAE适量，100V,电泳30min。B.3.5目的片段的克隆与分析电泳结束后，取出琼脂糖凝胶，使用Alpha凝胶成像系统观察并拍照记录。扩增片段与预期目标条带大小一致，则为阳性样品，表明植物叶片中携带该病毒见附录图B.4、B.5。图B.4茄科作物携带CMV的检测