DB37T 6092-2026 非洲猪瘟病毒核酸检测 微滴式数字PCR

ICS11.22037CCSB41山东省地方标准DB37/T60922026非洲猪瘟病毒核酸检测微滴式数字PCRDetectionofafricanswinefevervirusnucleicacidDropletdigitalPCR2026-10-12发布2026-11-12实施山东省市场监督管理局发布DB37/T6092—2026前言本文件按照GB/T1.1—《标准化工作导则第部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由山东省畜牧兽医局提出。本文件由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。究中心有限公司。本文件主要起草人：王苗利、兰邹然、薛瑞雪、富宏坤、陈静、吴少鹏、周献增、刘砚涵、李新、李波、杨晓雪、赵鲁、李法凯、邢东义、王志刚、李明祯、蔡青秀。IDB37/T6092—2026非洲猪瘟病毒核酸检测微滴式数字PCR12范围AfricanswinefevervirusASFVPCR方法。本文件适用于养殖场、屠宰场和无害化处理场猪只及其环境中的ASFV检测。规范性引用文件文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求34术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。原理将含有核酸模板的标准聚合酶链式反应（PolymeraseChainReactionPCR）体系，平均分配为数以万计的微液滴，使每个反应中含有一个模板，然后进行单分子模板的PCR反应。含有模板的液滴在扩酸拷贝数定量。5试剂或材料5.1试剂除非另有规定，仅使用分析纯试剂。5.1.1水：GB/T，一级。5.1.20.1mol/L磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferedSaline，PBS）（pH7.4），配制方法见附录A中A.1。5.1.30.04mol/LPBS（pH7.4），配制方法见A.2。5.1.450％甘油－PBS：配制方法见A.3。5.1.5青霉素，浓度为10000IU/mL。5.1.6链霉素，浓度为10000g/mL。5.1.7全基因组核酸提取试剂盒。5.1.8微滴式数字PCR反应试剂盒。5.1.9质粒提取试剂盒。1DB37/T6092—20265.1.10凝胶回收试剂盒。5.1.11琼脂糖。5.1.12DNAMarker。5.1.13ASFV阳性质控品。5.1.14ASFV阴性质控品。5.1.152×supermix反应液。5.2材料5.2.1器械：解剖刀、剪刀、镊子、骨锯、注射器及针头、组织匀浆器等。5.2.2容器：真空采血管（含抗凝剂）、离心管（2、10mL）、样品保存管、PCR扩增管等。5.2.3个人防护用具：防护服、防护镜、防护帽、防护靴、口罩、一次性手套等。5.2.4采样记录用品：采样单、记号笔、防水标签等。5.2.5其他：医用棉签、医用纱布、封口膜、冰袋等。6仪器设备6.1分析天平：精度0.001g。6.2生物安全柜。6.3高速冷冻离心机：转速不低于2000rpm。6.4涡旋振荡器。6.5核酸提取仪。6.6微滴生成仪。6.7紫外光度计。6.8核酸浓度测定仪。6.9微滴读取仪。6.10普通PCR扩增仪。6.11电泳仪。6.12微量可调移液器（2.5、10μL100μL200μL、1000μL等不同规格）。7样品7.1样品采集7.1.1口鼻拭子样品采集病死猪或发病猪、同群猪的口、鼻拭子。用医用棉签在口腔或鼻腔转动至少3圈，采集口腔、1mL50％甘油－PBS5.1.4去露出部分，盖紧离心管盖，密封后冷藏或冷冻保存。7.1.2全血样品EDTA5mL，密封后冷藏（2℃～8℃）或冷冻（－20℃以下）保存，长期保存应置－80℃超低温冰箱。7.1.3血清样品2DB37/T6092—2026在每一发病猪群中，采集发病猪、同群猪全血各5，室温放置12h～24h，分离血清，装入离心管中，密封后冷藏（2℃～8℃）或冷冻（－20℃以下）保存。7.1.4组织样品采集病死猪或扑杀发病猪的组织样品。首选脾脏，其次为扁桃体、淋巴结、肾脏、骨髓等。脾脏、肾脏采集约3cm×33cm。将所采集样品放入％甘油－PBS保存液中，密封后冷藏（2℃～8℃）或冷冻（－20℃以下）保存，长期保存应置－80℃超低温冰箱。7.1.5环境样品采集养殖场、屠宰场和无害化处理厂的环境样品，每个采样点采用棉签随机涂抹点不少于5拭子浸入1mL50％甘油－PBS保存液中，剪去露出部分，盖紧离心管盖，密封后冷藏（2℃～8℃）或冷冻（－20℃以下）保存，长期保存应置－80℃超低温冰箱。7.2样品处理7.2.1口鼻拭子、全血、血清和环境样品标记样品编号，立即进行ASFV检测或冷冻储存备用。7.2.2组织样品取适量采集的组织样品置于组织匀浆器中充分研磨，加入终浓度为1000IU/mL的青霉素、1000μg/mL的链霉素和灭菌的0.1mol/LPBS（pH7.45.1.22000rpm离心处理10min。取上清液，标记编号，立即进行ASFV检测或冷冻储存备用。8试验步骤8.1质粒的制备8.1.1质粒插入的目的片段p72（B646L）基因序列ASFV（230bp）ACGCATGTTCATCTATATCTGATATTAGCCCCGTTACGTATCCGATCACATTACCTATTATTAAAAACATTTCCGTAACTGCTCATGGTATCAATCTTATCGATAAATTTCCATCAAAGTTCTGCAGCTCTTACATACCCTTCCACTACGGAGGCAATGCGATTAAAACCCCCGATGATCCGGGTGCGATGATGATTACCTTTGCTTTGAAGCCACGGGAGGAATACCAA8.1.2重组质粒的构建及鉴定利用基因合成技术构建包含8.1.1PCR化质粒，转化感受态细胞中，挑选转化长出的菌落进行培养，提取质粒进行PCR鉴定，选择阳性重组质粒。8.1.3阳性重组质粒浓度的测定重组质粒作对应倍数稀释至1.0×105拷贝/μ。8.1.4阳性对照模板制备3DB37/T6092—2026将阳性重组质粒稀释到1.0×105拷贝μL作为阳性对照模板，进行10倍梯度稀释，浓度分别为5拷贝μL104拷贝μ103拷贝/L、2拷贝L、10拷贝/μ、1拷贝μL，－80℃保存备用。8.2核酸提取采用DNA提取试剂盒或核酸提取仪提取核酸。如在2h内检测可将提取的核酸置于冰上保存，或－202h内不检测的应放置－20阴性质控品。8.3引物与探针上游引物：5’－AGTTCTGCAGCTCTTACATACC－3’；下游引物：5’－GTGGCTTCAAAGCAAAGGTAAT－3(FAM)5’－TTCCACTACGGAGGCAATGCGATT3’(BHQ1)注：FAM6－羧基荧光素荧光基团标记、BHQ1为淬灭基团标记。8.4PCR不同浓度阳性对照模板数字PCR反应设置1的组分配制数字见表。PCR扩增完成后，读取微滴数据。ASFV阳性对照模板和阴性对照的数字PCR检测结果示例见附录B。表1PCR反应体系单位为微升组成2×supermix反应液F(10mol/L)R(10mol/L)Probe(10mol/L)ASFVDNA体积151.61.60.82DEPC水9总体积30表2扩增条件温度℃时间min10步骤循环数预变性变性951401940.51退火与延伸冷却551259结果判定9.1000阳性对照生成液滴总数高于20000，对应通道有阳性液滴数。4DB37/T6092—20269.2通道生成液滴数不低于000ASFV数低于20000需重做。10生物安全措施进行ASFV核酸检测时，如样品处理、核酸提取等，应按照GB19489的规定执行。5DB37/T6092—2026附录A（资料性）PBS及其保存液的配制A.10.1mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，7.4）氯化钠85.00g15.49g2.03g磷酸氢二钠磷酸二氢钠加去离子水至1000或者氯化钠80.0g2.0g氯化钾磷酸氯二钠磷酸二氢钾加去离子水至1000mL。30.0g2.0gA.20.04mol/LPBS（pH7.4）0.1mol/LPBS400mL600mL去离子水103kPa高压蒸汽灭菌30，室温或4℃冰箱保存。A.350％甘油－PBS保存液0.04mol/LPBS与纯甘油等量混合，调整pH值至7.4，分装成小瓶。1