第一章_细胞培养技术.ppt

1、第一章细胞培养技术,细胞培养技术在病毒学研究中的发展细胞培养概述细胞培养技术细胞培养污染与监测细胞培养技术在病毒学检验中的应用,由组织分散成的单个细胞或某一型细胞群进行的体外培养方法。即模拟体内的生理环境条件，提供细胞适宜的营养条件和温度，在无菌操作的基础上，使离体组织细胞生长增殖并进行传代的技术。,细胞培养技术的定义,第一节细胞培养技术在病毒学研究中的发展,细胞培养技术前，依赖动物、鸡胚分离培养病毒。1928年创立了组织细胞培养病毒方法，但鉴定仍要依靠动物实验。1949年判断病毒增殖的方法，如pH的改变，CPE作为第一个判定病毒增殖的指标，以后细胞表面出现血凝素或其他病毒抗原。1952年创立

2、病毒空斑试验技术进行病毒定量分析近年来，分子生物学和免疫学手段与细胞培养技术结合建立病毒快速检测技术。,组织细胞培养技术在病毒学研究中的用途,分离、鉴定病毒制备病毒抗原、疫苗测定病毒感染力和滴度在增殖病毒基础上可提高分子生物学方法鉴别、分析病毒的敏感度,组织细胞培养技术在病毒学研究中的优缺点,优点：对病毒的敏感性较高；无特异性抗体影响；某些病毒在敏感细胞上可引起细胞病变或血球吸附较为准确的定量和定位研究病毒。缺点:某些病毒没有敏感细胞；不能看到细胞变化,第二节细胞培养概述,体外培养细胞的生物学特性组织细胞培养的种类细胞系的建立、保存和鉴定用于病毒培养的细胞选择,体外培养细胞的生物学特性,组织来

3、源：胚胎或成体组织、正常或肿瘤组织生物学特性：细胞异质性、增殖和分化、细胞生长特征与形态生长繁殖过程：细胞周期、细胞生命周期生长基本条件,体外培养细胞,生长类型贴壁型：成纤维细胞、上皮样细胞、游走型细胞、多型性细胞接触性抑制和密度抑制悬浮型：部分癌细胞、白细胞,成纤维细胞,上皮样细胞,游走型细胞,多型性细胞,进行病毒培养需要获取大量可供长期而稳定的细胞材料，选择适合细胞增殖的条件。,细胞培养的基本条件,接种量：细胞单层速度营养物质：无机离子、氨基酸、碳水化合物、维生素、蛋白质（血清）酸碱度：6.67.8气体：O2、CO2温度：3337水：纯度高、无离子，现制无菌条件：抗生素,血清在培养细胞方面

4、有何作用？,组织细胞培养种类,器官培养组织培养细胞培养原代细胞培养、传代细胞培养（二倍体细胞、连续传代细胞）,各类细胞的优缺点,原代细胞：对病毒培养最敏感，但制备和应用不方便。二倍体细胞株：广泛应用于病毒的分离和疫苗生产，但只能传50代左右。传代细胞：仅能应用于病毒的分离和鉴定而不能用于疫苗生产。,细胞系的建立、保存和鉴定,细胞系和细胞株的概念细胞系或株的相关信息记录细胞系或细胞株的鉴定内容,用于病毒培养的细胞选择,细胞对病毒的敏感性研究目的研究病毒在不同组织细胞培养中特性病毒培养方法：静止培养、旋转培养、悬浮培养,第三节细胞培养技术,细胞培养的基本设施与条件无菌操作技术和细胞检查技术原代细胞

5、制备过程传代细胞制备及培养技术细胞的冻存、复苏及运输,细胞培养常用设备,超净工作台（生物安全柜）、倒置显微镜、水浴箱、离心机（高速冷冻）、CO2培养箱、冰箱、低温冰柜、液氮罐、高压灭菌器、干烤箱,器材的选择和处理,实验器材培养瓶、培养板、离心管、吸管等处理清洗（去污、去有机物、去离子）和无菌处理,培养用液和试剂,水：超纯水（电阻率18.2M）平衡盐缓冲液：（D-）Hanks液、PBS培养液：生长液、维持液细胞分散剂：胰蛋白酶、EDTApH调整液：NaHCO3溶液(7.0-7.2)指示剂：0.4%酚红溶液(6.8黄色)抗生素：100U或微克的青链霉素,常用培养液,天然培养液：体液和组织提取液，包

6、含血清、血浆、胶原牛血清：小牛、犊牛、胎牛，要求灭活5630min血清作用？存在的问题？合成培养基：按要求添加水、过滤除菌、以碳酸氢钠调节pH、加抗生素以及血清（促进生长）无血清培养基（serumfreemedium,SFM）,无菌操作和细胞检查技术,无菌操作技术实验前、操作区、无菌器材使用、火焰灭菌方法等细胞检查技术细胞形态、活力、细胞技术方法等,原代细胞制备过程,组织材料的选择和处理单细胞悬液制备细胞计数及分装细胞培养及观察以鸡胚成纤维细胞制备过程为例：,取胚,组织块制备,胰蛋白酶消化,分散细胞,计数细胞,分瓶培养,取孵化10d的鸡胚,消毒,破壳,揭壳膜和绒毛尿囊膜,无菌取出鸡胚,去除头部

7、和内脏,取胚,组织块制备,胰蛋白酶消化,分散细胞,计数细胞,分瓶培养,胚胎用Hanks液洗2次,剪碎,用含抗生素Hanks液洗2次,静止待组织沉积去除液体,取胚,组织块制备,胰蛋白酶消化,分散细胞,计数细胞,分瓶培养,加入5倍量胰酶消化液,37水浴消化（约20min）,组织块聚合成团,弃除胰蛋白酶液,用冷Hanks液洗2次,取胚,组织块制备,胰蛋白酶消化,分散细胞,计数细胞,分瓶培养,加9ml不含血清的营养液（DMEM）,用吸管吹打150次左右,用不锈钢网（100目）过滤,取胚,组织块制备,胰蛋白酶消化,分散细胞,计数细胞,分瓶培养,将细胞悬液作适当稀释,加入台盼兰混匀,取上述细胞悬液滴入计数

8、池,镜下观察并计数,取胚,组织块制备,胰蛋白酶消化,分散细胞,计数细胞,分瓶培养,将细胞悬液用培养液稀释1106,分装细胞培养瓶,37、5%CO2培养12d,形成细胞单层,可传代也可接种病毒,单层细胞培养过程游离期贴壁期繁殖期维持期衰退期,培养细胞观察内容：生长液的颜色；是否有污染；细胞生长状况；注意事项：24h内不应镜检或摇动；镜检和换液不宜在外放置过久，随用随放；注意放置培养瓶时的方向。,细胞的保存、复苏及运输,保存液：培养液、小牛血清、双抗、DMSO慢冻：-4、-20（-40）、-80、液氮（-196）复苏：37水浴1min，速溶运输：满瓶、冰盒,第四节细胞培养污染与监测,污染来源微生物

9、污染与监测细胞间交叉污染细胞污染防治措施,污染来源,组织：人和动物组织携带病毒血清和消化液：支原体操作：不同细胞株共用培养液空气：真菌器材：处理不当,细胞培养污染问题,微生物污染,细胞间交叉污染,猴类病毒禽类病毒人组织内在病毒支原体真菌细菌,微生物污染与监测,细菌和真菌支原体病毒,细胞污染防治措施,细胞组织来源血清来源无菌操作及规范操作加抗生素冷冻保存未污染细胞株一但污染如何消除？,第五节细胞培养在病毒学检验中的应用,分离培养病毒病毒性疾病的血清学诊断肿瘤病毒致癌机制研究药物体外抗病毒试验,分离培养病毒,常用敏感细胞标本前处理标本接种与培养方法病毒鉴定方法：细胞病变检查法、红细胞吸附试验、空斑试验、中和试验、电镜观察、免疫荧光技术、分子生物学技术,病毒的分离鉴定,直接观察细胞病变（CPE）细胞代谢间接观察红细胞吸附干扰现象（Nt）病毒滴度测定,细胞病变,细胞病变效应全变型包涵体型融合型,CPE:Cytopathologicaleffect多数病毒在细胞内增殖，可引起细胞形态学异常改变如细胞变圆、肿胀、坏死、脱落等,NDV感染BHK21细胞所引起的细胞融合（箭头所示）,包涵体：感染的细胞胞浆或胞核内出现嗜酸性或嗜碱性的圆形、椭圆形或不规则形状的团块结构,InclusionbodyofCMV:,观察细胞病变注意区别与老化细胞操作导致病变程度,Immunofluorescenc