流式基础原理

1、BD公司生物科学部技术支持蔡英Tel流式基础原理,Tohelpallpeoplelivehealthylives,成立于1897年，位居财富周刊500强产品涵盖诸多医疗领域：注射器、真空采血管、流式细胞仪1973年BD推出世界第一台流式细胞仪FACSI1980年中国的第一台流式细胞仪FACSII生物学、免疫学、遗传学、药理学、肿瘤学、血液学、临床检验等领域BDFACS流式细胞仪市场占有率：全球75%，中国80%,流式基本概念,流式细胞术的基本概念,流式细胞术（FlowCytometry,简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且能够同时检测快速直线流动状态中的单个细

2、胞的多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术，同时可以对特定群体加以分选。流式细胞仪（FlowCytometer）集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。,流式检测的样本,可检测的样本种类多样：各种细胞（如外周血，骨髓，细针穿刺，灌洗液，实体组织，悬浮或贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球等New!血清、血浆、培养上清、细胞裂解液样本制备：单细胞悬液（天然，机械研磨/消化）51051106cells/ml，约0.51ml，300目筛网过滤,流式细胞仪的检测范围,细胞结构细胞大小细胞颗粒度细胞表面积核浆比例DNA含量与

3、细胞周期RNA含量蛋白质含量,细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内/外的细胞因子激素结合位点、细胞受体蛋白磷酸化pH值钙离子浓度细胞膜电位、线粒体膜电位,流式细胞仪的检测信号,散射光信号,当细胞颗粒通过聚集的激光束时，激光向各个方向散射。与激光束方向同轴的称前向角散射光信号（FSC）。与激光束垂直的称为侧向角散射光信号（SSC）。,散射光信号,RightAngleLightDetectorCellComplexitySSC,ForwardLightDetectorCellSurfaceAreaFSC,IncidentLightSource,前向角散射光（FSC,ForwardS

4、catter）细胞相对大小及其表面积侧向角散射光（SSC,SideScatter）细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性,前向角散射光信号,侧向角散射光信号,外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）,颗粒杂质、气泡对检测的影响,荧光信号,使用不同荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量,荧光样本制备,双色直接染色,荧光素的激发和发射光谱,任何发荧光的物质分子都具有这两个特征光谱（nm）激发光谱（Excitation，Ex）：是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线，也称为吸收光谱。吸收波峰（最大吸收波长）：Ex-Max发射光谱（Emission，

5、Em）：是指某一波长激发光引起荧光素发射的一定波长范围内的荧光发射波峰（最大发射波长）：Em-Max荧光素的使用：选择正确的激光器确定所需探测器（PMT）,区别,光学系统：滤光片,如何将一束混合的荧光区分开来，分别进行收集呢？滤光片置于荧光探测器前，限定其接收的荧光的波长范围,Longpass(LP)Shortpass(SP)Bandpass(BP),FluorescenceSpectrumViewer,FluorescenceSpectrumViewer,FluorescenceSpectrumViewer,FluorescenceSpectrumViewer,FluorescenceSpe

6、ctrumViewer,FluorescenceSpectrumViewer,FluorescenceSpectrumViewer,流式数据分析形式,数据存储,FCS2.0格式常以列表模式（LISTMODE)：将每个细胞的每个检测参量依次排列顺序存储,FITC/PE双染样本,数据显示,直方图（Histogram）二维点图（DotPlot）等高线图（ContourPlot）密度图（Density）三维图（3DPlot）等,单参数直方图分析,荧光峰的高低即在纵轴对应的高度反映了？,荧光峰的高低即在纵轴对应的高度反映了具有此种荧光强度的细胞在样本中所占比例的相对多少，而非绝对数目,双参数散点图分析,

7、等高图和密度图,流式细胞仪的组成和工作原理,流式对照的设置,荧光染色对照的设置1,阴性对照空白对照自发荧光，即不经荧光染色细胞内部荧光分子经光照发出的荧光。自发荧光信号为噪声信号。一般说来，细胞成分中能产生自发荧光的分子（核黄素、细胞色素等）的含量越高，自发荧光越强，如肿瘤细胞、粒细胞等；样本死细胞比例越高自发荧光越强实验样本特异荧光，即抗体F(ab)2段与细胞抗原特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光非特异荧光，即抗体Fc段与细胞表面的Fc受体非特异结合上的荧光染料受光照发出的荧光自发荧光特异荧光非特异荧光同型对照（自发荧光非特异荧光）,合适？,同型对照,同型对照（IsotypeControl

8、）：与实验染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型（即Fc段相同，F(ab)2段不同）与染色的单克隆抗体相同种属来源相同免疫球蛋白及亚型相同荧光素标记相同剂量和浓度但由未免疫动物血清纯化而来用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面的Fc受体而产生的背景染色例如，标记FITC的单克隆抗体为小鼠IgG1亚类抗体，标记PE的单克隆抗体为小鼠IgG2a亚类抗体，同型对照应用相同浓度和剂量的未免疫小鼠血清的纯化IgG1（1）和IgG2a（2a），并分别标记FITC和PE,商业化荧光素的发射光谱,spectraloverlap,FluorescenceSpectrumViewer,spectralover

9、lap如何解决？,荧光染色对照的设置2,补偿对照（双色或多色分析中，荧光素发射光谱重叠时）荧光补偿（compensation）是指在流式细胞多色分析中，纠正荧光素发射光谱重叠（spectraloverlap）的过程，即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号已染色样本？真双阳？假双阳？,双色荧光补偿1,双色荧光补偿2,双色荧光补偿3,荧光染色对照的设置2,补偿对照（双色或多色分析中，荧光素发射光谱重叠时）荧光补偿（compensation）使用单种荧光素标记的单克隆抗体和其余荧光素对应的同型对照抗体分别进行染色几色分析需要制备几个补偿对照管,流式网络资源,关键词搜索：FCM，FACS

10、，流式（中文）,白血病免疫分型,FAB分型：AL分为AML（M0-M7）&ALL白血病的MICM分型MorphologyImmunologyCytogeneticsMoleculorGenetics白血病分型是选择化疗方案和判断预后的重要依据。白血病免疫分型是MIC分型的重要组成部分，也是对FAB分型的补充，对白血病的诊断、治疗策略制定、预后判断及对白血病发病机制的研究都具有重要作用。,白血病细胞特性：,白血病细胞的异常表现在抗原系列异常和时间异常异常抗原表达(AberrationAntigenExpression)丧失系列规律性（lineageinfidelity)过高，过低，不表达，交叉丧

11、失分化发育的阶段性（differentiationasynchrony)早期与晚期抗原同表达,白血病免疫分型抗原,常用白血病细胞系列与分化阶段抗原,白血病细胞系列非特异性抗原：干/祖细胞：CD34+、HLA-DR+、CD38-原始细胞：CD34+、HLA-DR+、CD38+幼稚细胞：CD34-、HLA-DR-、CD38+,白细胞共同抗原：CD45,CD45的临床应用,所有人类白细胞均表达CD45，包括淋巴细胞、单核细胞、多形核细胞、嗜酸、嗜碱性细胞以及骨髓前体细胞等。造血系统细胞CD45表达量与细胞分化程度的高低紧密相关，即分化程度高的细胞CD45表达量高，分化程度低的细胞CD45表达量低（淋

12、巴细胞单核细胞成熟粒细胞原幼细胞，在红细胞中不表达；SSC是侧向角参数，反应细胞的颗粒度（成熟粒细胞单核细胞原幼细胞淋巴细胞）。目前，国际上采用CD45/SSC设门，可非常轻松地将白血病细胞与正常细胞分开，增加白血病免疫分型的准确性,CD45的临床应用,用CD45-SSC设门寻找异常细胞，将细胞分为5个群体，当幼稚细胞达70-80%时，即可大致估计AL的类型,正常人血液白细胞免疫表型散点图,正常人血液细胞免疫表型,T淋巴细胞：CD45+、CD3+/CD4+、CD3+/CD8+、CD5+/CD7+，部分细胞CD（16+56）+，无CD4+CD8+双阳性细胞B淋巴细胞：CD45+、CD10-/CD

13、19+、CD20+/CD22+、HLA-DR+/CD13-NK细胞：CD45+、CD（16+56）+/CD3-单核细胞：CD45+、HLA-DR+/CD13+、CD14+/CD33+中性粒细胞：CD45+、HLA-DR-/CD13+、CD14-/CD33+，CD13比CD33表达更高嗜酸性粒细胞：CD45+、HLA-DR-/CD13+、CD14-/CD33+，CD13比CD33表达更高,正常人骨髓有核细胞免疫表型散点图,急性T淋巴细胞白血病（T-ALL）骨髓细胞免疫分型散点图,急性早幼粒细胞白血病（AML-M3）骨髓细胞免疫分型散点图,FCM在临床血液学中的应用,能正确区别AML和ALL，并能进一步区别ALL中的T系和B系及亚型能正确鉴别AML中难于鉴别的