细胞的脂质体转染法和电穿孔法

1、细胞的脂质体转染法和电穿孔转染法（一）脂质体转染一、 实验试剂及器材Lipofectamine 3000 Transfection Reagent，质粒DNA(0.5-5 g/L储液)，Opti-MEM减血清培养基，培养板，酒精灯，离心机，微量移液器，离心管等。二、 实验步骤1. 接种细胞至7090%汇合度时转染；2. 使用Opti-MEM减血清培养基稀释Lipofectamine 3000试剂（2管），充分混匀（6孔板Opti-MEM培养基为125 L2，Lipofectamine 3000为3.75和7.5 L）；3. 在每管已稀释的Lipofectamine 3000试剂中加入稀释的DN

2、A（用P3000TM试剂稀释）（1:1比例）；4. 室温孵育5分钟；5. 加入DNA脂质体复合物至细胞中；6. 37C(PK-15在39C下培养)孵育细胞24天，然后分析转染细胞。三、 注意事项1. 在无血清培养基（如Opti-MEM减血清培养基）中制备DNALipofectamine 3000脂质体复合物，直接将其加入含细胞培养基的细胞中（在血清抗生素存在或不存在时均可）；2. 转染后无需去除转染复合物或者更换添加培养基；3. Lipofectamine 3000试剂用量各有不同，测试推荐的两种浓度的Lipofectamine 3000试剂，以确定最佳用量，开始新的转染；4. Lipofec

3、tamine 3000试剂应放在4储存（切勿冷冻）。附上Lipofectamine 3000 REagent Protocol：（二）电穿孔转染法一、 实验试剂及器材BTX ECM20012001细胞电融合仪，细胞，胰蛋白酶，电转液，DMEM，培养板，离心机等。二、 实验步骤1. 电穿孔前一天，以合适密度传代细胞，使细胞在转染时处于对数生长期（细胞达到7090%汇合度）；2. 根据细胞密度和数量取适量的胰蛋白酶消化收集贴壁细胞（对于PK15，一般6孔板需要加入0.25胰酶溶液0.5-1mL孔，39C培养箱孵育5-10min，在显微镜下观察到有少量细胞开始脱落即加入含血清的培养基终止消化），反复

4、吹打使贴壁细胞完全脱离下来并分散成单细胞；3. 将细胞悬液收集到洁净无菌的离心管中，先用DPBS重悬细胞，2400rpm离心3.5min，弃上清，再用电转缓冲液将细胞重悬，再次离心（为了确保将细胞彻底洗涤干净，可以用电转缓冲液洗细胞两次）；4. 弃上清，加入适量电转缓冲液和质粒，反复吹打使细胞、质粒和电转液充分混匀，细胞浓度最好在2106-2107之间（需要对细胞进行计数）；5. 设置好电转参数（90 V110 V, 3ms, 1pulse，具体电压值需要摸索）吸取适量的细胞混合液加入洁净的电击杯（电击杯直径10mm对应样品总体积50 L）尽量混匀，避免气泡，然后将电击杯放入电击卡槽里，放置电

5、击杯时一定要使电击杯金属面和卡槽电极紧贴，关上盖子，按Automatic start进行电击；6. 电击完成后可见wait指示灯停止闪烁后，取出电击杯，用细长的吸头吸出样品转入提前预热好的非选择性培养基内；7. 做好相关的标记，将培养板放入39C、5%CO2培养箱培养，关闭仪器电源并清洗电击杯（清水蒸馏水酒精干燥）；8. 培养24小时后，观察细胞生长情况，计数，统计转染效率，拍照记录。稀释15倍以上，用选择培养基培养。2-4天换液，直至抗性克隆形成。如用于筛选单克隆，HeLa细胞电击24小时后计数，细胞用选择培养基（G418, 0.5 mg/mL）稀释。三、 注意事项1. 细胞电融合仪开机预运行1-2min；2. 参数设置：包括电压、电击时间和电击次数，工作电压所需电压电击杯宽度，单位一定要统一（PK15细胞和成纤维细胞的参数相似：130V，3