级肿瘤学临床.ppt

1、,第七章细胞周期与肿瘤肿瘤共同特征:细胞周期调控机制的破坏,细胞失控性生长。第一节历史回顾一、生命复制之迷被一层层揭开第一次看见细胞；细胞理论;细胞生长过程:有丝分裂期、细胞间期；1951年，细胞周期G1期、S期、G2期、M期。传统细胞周期分析：细胞的同步化；S期或M期始末时间的观察。,流式细胞术多参数流式细胞术DNA/RNA同步分析法成熟促进因子MPF:正常有丝分裂的启动因子细胞分裂周期基因cdcMPF:p34cdc2/28，CDKs(细胞周期素依赖性蛋白激酶)细胞周期素Cyclins二.肿瘤发生、发展研究与生命复制研究的会合癌基因时代抑癌基因时代多基因时代、癌基因蛋白网络时代肿瘤多步骤理论

2、、DNA修复理论、细胞凋亡理论细胞周期核心理论,三、肿瘤与细胞周期研究的重大突破肿瘤是多基因变化导致细胞周期紊乱，细胞失控性生长所致的一类疾病。肿瘤是多步骤发生、多基因突变的进化性疾病。1.“二次打击学说”：视网膜母细胞瘤具有一种遗传缺陷的子代只是易患肿瘤，还需要另外的基因缺陷，才发生肿瘤。肿瘤抑制基因从结构破坏到功能丧失。,2.肿瘤发生发展是一个细胞克隆进化的过程结肠癌：APC(肿瘤抑制基因),ras（信号转导途径),p53（肿瘤抑制基因)，DCC（粘附因子)基因阶段性突变癌基因、抑癌基因的功能效应，都从不同的途径最终会聚到细胞周期机制上来，直接参与调控或作为细胞周期调控机制的主要成分。肿瘤

3、是一类多步骤、多基因突变所致的细胞周期调控机制破坏、细胞克隆性、进化性疾病。,第二节细胞周期机制的核心CDKs调控机制间期：G1、S、G2期有丝分裂期：M期细胞周期调控核心机制：依赖于细胞周期素特异性、时相性表达、累积与分解的CDKs的时相激活。CDK催化亚单位：底物结合部位含ATP结合位点侧链,细胞周期调控核心：蛋白激酶M期：CDC2cyclinB1；G2期：CDK2cyclinA；S期：CDK2cyclinE;G1期:CDK4,6-cyclinD1,D2,D3细胞周期过程中，某一CDK含量恒定，活化与非活化CDK的总量不变。,一、Cyclins是调控CDKs活性的最基本成分特异性区域：细胞

4、周期素盒cyclinbox：结合并激活CDK；特别区间：引导CDKs到特定底物亚细胞部位。Cyclin蛋白功能：激活CDKs并加强CDKs对底物的作用。Cyclin功能的调控：依赖其蛋白质水平的细胞周期特异性起伏。,细胞周期调控蛋白的降解，控制着细胞周期内一系列事件的运行顺序、方向和协调。1.蛋白质降解：1983年首次提出；1989年进一步实验证实；1991年实验确认。,2.泛肽化介导的蛋白质水解：多个泛肽链接在底物上，被蛋白酶体识别、降解E1激活酶：E1泛肽羟基硫酯结合；E2结合酶：E3连接酶：靶蛋白的赖氨酸残基SCF：G1/S期APC(anaphasepromotingcomplex)：M

5、期,3.G1-S转换中的蛋白质水解SCF复合物：Skp1、Cdc53/cullin、F-box(Protain)有丝分裂的关键调控蛋白Weel也同样受到SCF系统的调控：当Weel降解后，伴随着DNA复制的完成，细胞进入有丝分裂期。SCF系统的两类底物：cdc4Sicl,4.有丝分裂中蛋白质水解APC：有丝分裂后期促动因子复合物Cdc16,Cdc23,Cdc27CyclinB/Cdk1：1）驱动着细胞进入有丝分裂期，阻滞细胞完成有丝分裂；2）灭活机制：APC催化CyclinB降解;CDK抑制物Sic1与CyclinBCdk1复合物结合;CyclinB降解,Cfi1：细胞间期，核仁，直接与Cdc

6、14结合；使Cdc14磷酸化失活；Cdc14：1）磷酸酶，使转录因子Swi5去磷酸化，产生新的Sci1，后者被CyclinB/Cdk1磷酸化而降解；2)使Sci1去磷酸化，降低CyclinB/Cdk1活性，通过Cdh1去磷酸化，能与APC结合，使CyclinB降解，CyclinB/Cdk1复合物彻底失活。APC激活，使CyclinB降解，CyclinB/Cdk1复合物灭活和Sci1累积，使细胞出有丝分裂后期，完成有丝分裂，进入早G1期。,二、Thr160/161磷酸化Thr160/161磷酸化是CDK激活的重要条件。CAK(CDK-activatingkinase)：CDK激活性蛋白激酶1)催

7、化亚单位蛋白激酶MO1(CDK7);CyclinH；2)一种CAK能使所有主要的CDK-Cyclin底物磷酸化而激活；3)活性在细胞周期中无起伏状态；4)不是限速步骤。,灭活CDK-Cyclin复合物重要机制：1）Cyclin的去除；2）Thr160/161去磷酸化.三、Thr14/Tyr15磷酸化和去磷酸化是CDK激活及失活的重要环节。磷酸化蛋白激酶Weel,使CDC2上的Thr14/Tyr15磷酸化；磷酸酶CDC25使CDC2上的Thr14/Tyr15去磷酸化。,CDC2的激活过程：CyclinB1与CDC2结合；Weel对Thr14/Tyr15进行磷酸化，抑制CDC2的活性；CAK对Th

8、r160/161进行磷酸化;CDC25激活，使Thr14/Tyr15去磷酸化；CDC2被激活。,CDK激活条件：1.与特定Cyclin结合；2.Thr14/Tyr15磷酸化及去磷酸化；3.CAK使Thr160/161磷酸化；4.Cyclin-CDK活性高于CKI。CDK失活条件：1.Cyclin降低；2.Thr14/Tyr15磷酸化；3.Thr160/161去磷酸化；4.TGF-1存在（CyclinD,E-CDK2,A）；5.CKI结合并失活Cyclin-CDK。,四、细胞周期依赖性蛋白激酶抑制物调控CDKs活性机制：Cyclins、CAK、Weel/Cdc25的磷酸化和去磷酸化、CKIs（细

9、胞周期依赖性蛋白激酶抑制物）CKI家族两大类：1)Cip/Kip家族：p21p27p57N端:与CDK结合的相同结构域；与CDK结合后，抑制G1、S期Cyclin-CDK,是控制G1/S转换的CDK的抑制剂；C端:结构与功能各不相同。,特点：p21C端有PCNA结合结构域，p21有两个p27结合位点2)INK4家族：p15p16p18p19主要与CDK4、CDK6的抑制密切有关。特点：p16不随细胞周期时相变化；p19随细胞周期规律性震荡。TGF-1能促进p15mRNA表达，抑制细胞增殖。,CKIs所识别的是多数CDK-Cyclin复合物，不是CDK单体；p16INK4a同CDK4单体结合。当

10、DNA损伤及细胞衰老，具有转录因子作用的p53增高，诱导p21Cip1的转录增强，后者与相应的CDK-Cyclin复合物结合，抑制蛋白激酶的激活，阻滞细胞周期的进行。,第三节细胞周期调控的两大机制一系列Cyclins时相性起伏，相应CDKs依次激活，驱动细胞通过G1、S、G2期，到达M期。一、细胞周期的启动机制主要调控点：G1期酵母：“起始点”START，细胞内外信号人类细胞：“限制点”restrictionpoint，早期应答基因（c-Fos,c-Jun),延迟应答基因(CyclinD),信号转导细胞周期的联结途径：CyclinD-Cdk4/6CyclinE-Cdk2G1期限速步骤,生长信号

11、（信号途径、早期应答基因）CyclinD,CyclinD-Cdk4/6CyclinD-Cdk4/6-p27Kip1复合物Cdk4/6摄取、转移磷酸基团1）pRB低磷酸化状态：pRB与E2F结合，抑制S期必须基因产物表达，阻止G1/S、DNA合成，阻断细胞周期；,2）pRB高磷酸化状态：pRB失活，释放转录因子（如E2F），产生多种蛋白质，驱动细胞周期的进行；CyclinE升高，CyclinE-Cdk2复合物，促使p27Kip1减少，Cdk2活化；CyclinE-Cdk2使p27Kip1磷酸化，成为泛肽化蛋白水解的靶，降解。正是Rbpathway的E2F正反馈机制协同p27Kip1降解机制，使细

12、胞在“restrictionpoint”后，越来越少地依赖生长因子或有丝分裂因子。,二、细胞周期的监控机制检测点checkpoint功能分类:DNA损伤检测点时相次序检测点监控机制:探测部分（特定基因产物）制动部分（细胞内信号转导）检修部分处理部分,1.DNA损伤检测点p53pathway;Cdc25pathwayDNA损伤，信号传递给p53;p53稳定性增高，p53蛋白水平升高;启动p21的转录，p21蛋白迅速升高，与多种CDK-Cyclin复合物直接结合,抑制CDKs的激活，阻滞G1/S的过渡，为修复DNA提供足够的时间。,ARF-Mdm2-p53pathwayINK4a基因编码p16IN

13、K4a、ARF/p14ARF）。Rbpathway激活后，E2F1、Myc等将导致ARF蛋白的积累：1）破坏Mdm2的功能（阻断p53转录、使p53泛肽化、强制性使p53转运到胞浆中），结果是p53出现积累，导致细胞周期运行滞留，乃至发生细胞凋亡；2）细胞对DNA损伤更为敏感。,G2期检测点：当DNA损伤，激活hATM/hATR，使Chk1蛋白激酶磷酸化，作用于磷酸酶Cdc25(Ser-216磷酸化)，磷酸化后Cdc25与14-3-3蛋白结合、扣留、失活，不能将CDC2蛋白激酶Thr-14/Tyr-15位去磷酸化，使CDC2不能激活，导致G2期阻滞。,2.时相次序检测点有丝分裂与DNA复制严格

14、的时相次序。1）有丝分裂促进因子MPF：G2、S期，诱发有丝分裂；染色体凝集。2）S期促进因子SPF：诱发G1期细胞核进入S期；S期CDKs存在于S期的开始到M期的结束；只启动一次DNA复制。,3）S期启动(1)S期开始前组装pre-RC（复制前复合物）ORCCdc6pMcm(2)S期CDKs和DDK（Cdc7-Dbf4）共同启动DNA的复制。4）S期CDKs的双重功能：引发DNA复制的启动；防止pre-RC重复组装。M期CDKs：防止pre-RC重复组装。,5）有丝分裂后期促进复合物（anaphase-promotingcomplex,APC,cyclosome)：调控姐妹染色体的分离和M期

15、Cyclin的降解。M期CDKs的激活并积累使APC处于活化状态，一直持续到G1期；G1期CDKs的激活并积累又抑制了M期Cyclin和APC底物的成熟前累积。,第四节细胞周期的界面机制细胞周期与信号转导、基因转录、DNA修复、细胞凋亡、细胞分化等多种生命活动密切相关。一、细胞周期与DNA修复发现DNA损伤/错误的传感器，受损细胞的扣留，修复DNA，决定继续分裂或死亡。,传感器：人类ATM，p53基因ATM编码蛋白激酶，结合在损伤的DNA上，能将某些蛋白磷酸化，中断细胞周期。信号通路：1）激活Chk1，引起Ser216磷酸化，抑制CDC25，抑制M-CDK，阻断细胞周期；2）激活Chk2，使p

16、53磷酸化，p21表达增加，抑制G1-S期CDK，阻断细胞周期。低等生物Rad24，Rad17，Mec3，DDC1，Rad9,Rad9，Rad24与单链DNA结合，激活蛋白激酶Mec1，使Rad9、Rad53、Pds1等蛋白磷酸化，导致G2/M期过度的阻滞；Mec1激活Rad53，调节Sml1，导致dNTP合成增加，以供DNA修复需要；Mec1、Rad53及Dun1的激活，使Crt1磷酸化，解除转录抑制，开始DNA修复。,DNA修复的两大类形式：1）切除修复(excisionrepair)：碱基切除修复BER：酶切错误的碱基并替换核苷酸切除修复NER：单个核苷酸或一段寡核苷酸切除、修复。全基因

17、组切除修复：蛋白质/DNA直接作用识别、修复，可发生在基因的任何部位；,转录切除修复：在转录过程中完成切除、修复TFIIH，是一个多功能蛋白复合物，由XP-B、XP-D和TTD-A基因的蛋白产物构成，与基因转录的启动密切相关。在CAK的作用下，TFIIH被激活。TFIIH将细胞周期、基因转录、DNA修复联系在一起。,2）错配修复(mismatchrepair)：MSH2基因产物识别;与DNA直接形成复合物;内源性核酸酶和核酸多聚酶作用,去除重复错配的DNA链二、细胞周期与细胞凋亡不同因素诱导的细胞凋亡，发生在细胞周期的不同时相。,三、细胞周期与细胞分化角化细胞分化:p21Cip1与细胞分化有关

18、;角化细胞分化时，p21Cip1水平下降；当细胞增殖时，p21Cip1能抑制角化细胞分化，同时与DNA多聚酶的主要成分PCNA结合，影响细胞周期中DNA合成期的进行。,Rb的研究中发现，Rb磷酸化时，能释放所“扣留”的转录因子E2F，驱动细胞周期的进行；当Rb处于去磷酸化状态时，促使成肌细胞/脂肪细胞分化,第五节肿瘤细胞周期机制的破坏甲状旁腺腺瘤-CyclinD1基因突变肝细胞癌-乙肝病毒嵌入CyclinA基因序列乳腺癌-CyclinE过度表达从三个方向（细胞分子生物学、肿瘤生物学和临床肿瘤学）、三类基因（癌基因、抑癌基因和肿瘤易感基因）、三种细胞归宿（细胞分裂、细胞分化和细胞死亡）会聚到细胞

19、周期调控机制，对肿瘤发生、发展的认识集中在三个层面：,监控机制/保真性（fidelity）驱动机制/决策性（decision）相关生物学/延伸性（expanding）一、细胞周期监控机制的破坏肿瘤是一类多基因疾病：1）遗传物质DNA（或基因）的改变；2）多步骤、多基因变化；3）最终导致细胞的失控性生长。,DNA损伤检测点1）G1-S过渡期：防止DNA受损细胞进入S期，2）G2-M过渡期：防止受损的DNA和未完成复制的DNA进入有丝分裂。DNA损伤检测点的主要机制1）p53依赖性机制2）p53非依赖性机制,检测点的四部分功能：发现detect、制动stop、工作work、决定decision典型

20、例子-p53基因的突变DNA病毒（SV40、HPV、腺病毒等），首先导致遗传的不稳定性，通过其产物，结合并使p53蛋白灭活，减弱细胞周期检测点功能；缺乏p53或AT基因的细胞，经放射线照射后，遗传的不稳定性明显增加，即使该基因是杂合性丢失，也将导致乳腺癌。,二、细胞周期驱动机制的破坏在正常细胞S期，CyclinA蛋白与转录因子E2F结合。研究发现，肝细胞癌的细胞中，乙肝病毒的DNA片段整合到了CyclinA基因中；在腺病毒转化的细胞中，CyclinA与腺病毒转化蛋白EIA结合在一起。,PRAD1与bcl-1基因序列联在一起，在B淋巴细胞白血病时，bcl-1移位到免疫球蛋白基因增强子而被激活；在

21、甲状旁腺肿瘤细胞中，染色体重排，使PRAD1与甲状旁腺激素基因的增强子并置，导致PRAD1大量表达。正常情况下，PRAD1产物能激活Cdc2/Cdc2类蛋白激酶（CyclinD1）。,直接的CKIs、Rb和p53的破坏更常见。DNA损伤所致的经典途径p53-p21-CDKs-CyclinsDNA损伤p53表达增加p21Cip1转录增加细胞周期运行受阻p53突变时，丧失了促进p21Cip1转录的功能，导致含有受损DNA的细胞，仍然处于细胞周期运行中复制。,p21Cip1的双重制动作用：1）抑制CDKs的活性；2）直接结合，抑制增殖细胞核抗原。,“多肿瘤抑制基因”MTS1（multipletumo

22、rsuppressor）：编码蛋白产物为p16，一种蛋白激酶抑制物，1）特异性抑制Cdk4-CyclinD蛋白激酶的活性；2）不能对其底物Rb进行磷酸化，阻止了G1-S的过渡；3）使CyclinD不能连接生长因子信号转导与细胞周期调控机制，阻碍细胞的生长、复制与分裂。,第六节问题与展望细胞周期核心机制的精确解剖细胞周期界面联系的精确解剖,第一节历史回顾第二节细胞周期机制的核心CDKs调控机制Cyclins是调控CDK活性的最基本成分Thr160/161磷酸化Thr14/Tyr15磷酸化和去磷酸化细胞周期依赖性蛋白激酶抑制物第三节细胞周期调控的两大机制细胞周期的启动机制细胞周期的监控机制,第四节

23、细胞周期的界面机制细胞周期与DNA修复细胞周期与细胞凋亡细胞周期与细胞分化第五节肿瘤细胞周期机制的破坏细胞周期监控机制的破坏细胞周期驱动机制的破坏第六节问题与展望,第九章细胞凋亡与肿瘤1858年细胞退化、坏疽、软化、坏死；1885年“染色体裂解”；1914年提出了平衡机制，认为是生理性清除细胞；1951年提出“程序化细胞死亡”；20年后提出“固缩性坏死”,1972年正式以“细胞凋亡”（apoptosis）命名1976-1981年发现“梯样”DNA电泳图谱；1984年发现内源性核酸酶的激活；直到20世纪80年代末期，才真正开始认识到细胞凋亡的生物学意义。,第一节细胞凋亡的特点及其意义一、细胞凋亡

24、的基本特点及其评价方法（一）凋亡细胞的形态学特征胞浆空泡，膜发泡，空泡排出，细胞固缩，细胞体积缩小；细胞膜和核膜保持完整；线粒体超浓缩、染色质进行性固缩，核凝聚；核周出现块状结构、“致密球体”或葡萄串样小球体或半月形，凋亡小体存在。,（二）非随机性DNA降解琼脂糖凝胶电泳呈现DNA梯状图谱（DNAladder），是细胞凋亡的重要生物化学标志。原位末端标记（insiteendlabeling，ISEL）技术：根据DNA聚合酶能够填补双链DNA中单链的缺失部分，应用标记的三磷酸核苷酸形成新的DNA。）DNA缺口平移法：）原位末端标记法：）末端DNA转移酶dUTP缺口末端标记法。,（三）细胞膜磷脂酰

25、丝氨酸外翻胆碱类磷脂（磷脂酰胆碱、鞘磷脂）氨基类磷脂（磷脂酰丝氨酸PS、磷脂酰乙醇胺）PS外翻现象是早期凋亡细胞重要特征之一。由于Ca+依赖的磷脂结合蛋白annexinV能与PS高亲和结合，同时结合膜非通透性DNA染料（PI）则能从染色细胞中将凋亡和坏死细胞区分开来。,（四）保持充足的能量代谢直至细胞凋亡末期在ATP存在下，钙亲合剂诱导细胞凋亡；反之，诱导细胞发生坏死。在预先耗竭ATP的情况下，凋亡诱导剂和Fas配体诱导的T细胞死亡形式由凋亡转向死亡。（五）细胞凋亡的结局凋亡小体（apoptoticbody）,细胞凋亡与细胞坏死的区别：1）形态学：细胞体积细胞膜、细胞器、细胞核溶酶体、线粒体2

26、）生物化学：DNA、蛋白质（Caspases）底物、抗死亡分子对ATP的需求3)组织分布、组织反应,形态学改变的检测方法1.普通光学显微镜；2.荧光显微镜；3.电镜；4.凋亡指数和细胞活力定量测定生物化学方法（琼脂糖凝胶电泳）免疫学方法（ELISA法）原位末端转移酶标记技术（荧光酶标记）靶细胞DNA片段定量分析及细胞溶解试验流式细胞分析技术,二、流式细胞仪在细胞凋亡研究中的应用流式细胞仪是分析细胞学研究的重要工具。三、细胞凋亡的生物学意义概述细胞凋亡具有极其广泛的生物学意义，涉及胚胎发育、形态发生、细胞稳定及免疫防御机制等诸多方面。细胞凋亡的异常，可引起多种疾病（自身免疫性疾病、神经退行性疾病

27、、恶性肿瘤等发生）。,研究细胞凋亡具有重要的生物学意义：细胞凋亡在维持组织及器官的正常形态和功能方面起着重要作用；细胞凋亡在肿瘤形成和治疗中具有重要作用；细胞凋亡与免疫学关系十分密切。,第二节Caspases和死亡受体相关的细胞凋亡途径细胞凋亡的过程分为三个时期：诱导期效应期降解期在研究模型中，发现三个重要基因：促进细胞凋亡基因：ced-3、ced-4抑制细胞凋亡基因：ced-9,CED-3：半胱氨酸蛋白酶，激活的CED-3特异性降解蛋白底物；CED-4：与CED-3结合并促进CED-3激活，CED-9：与CED-4结合并阻止它激活CED-3,诱导、调控凋亡的基本机制：在凋亡诱导信号作用下，C

28、ed-9自三体复合物（Ced-3-Ced-4-Ced-9）中解离，导致Ced-4激活Ced-3，活化的Ced-3特异地降解蛋白底物，最终发生细胞凋亡。哺乳动物体内，caspases与ced-3同源；Apaf-1基因与ced-4同源；Bcl-2基因家族与ced-9在结构和功能上相似(分为促进和抑制亚群),哺乳动物细胞凋亡的主要途径：死亡受体途径、线粒体途径。凋亡后期的共同途径：Caspases激活一、Caspases的结构和活性特点1993年，发现白细胞介素-1转化酶ICE（interleukin-1B-convertingenzyme）与Ced-3基因存在功能和序列相似性。1996年，统一命名

29、为天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(caspase)。,ICE分为2个亚族ICE亚族：参与炎症反应CED-3家族：参与细胞凋亡启动者：caspase-8、9，能通过自剪接而激活，然后引起caspase级联反应；执行者：caspase-3、6、7，可直接降解胞内的结构蛋白和功能蛋白，引起凋亡，但不能通过自催化或自剪接的方式激活,Caspase分子是一类在进化上非常保守的蛋白酶类分子。Caspase的特性表现在两个方面（）为半胱氨酸蛋白酶类；（）切割天冬氨酸的羧基与下一个氨基酸的氨基形成的肽键。Caspase属于半胱氨酸蛋白酶，能特异地剪切割天冬氨酸残基后的肽键。,Caspases家族成员具有相似的氨

30、基酸序列、结构和底物特异性。Caspase前体：原结构域、大亚基和小亚基。Caspase前体的活化，涉及结构域间的蛋白水解和大小亚基整合形成异二聚体。基于Caspases的严格底物特异性和高度有效性，从而确保了细胞凋亡过程中发生专一性的蛋白消化。,二、死亡受体和Caspases的活化死亡受体（deathreceptor,DR）：传递细胞凋亡信号的细胞膜蛋白.肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族.分为两大类：上游始动Caspases（Caspase-2,-8,-9,-10）下游效应Caspases（Caspase-3,-6,-7）,Caspases活化的“级联”模型：凋亡诱导信号始动Caspase

31、s活化活化下游Caspases参与重要底物的剪切,死亡受体结构特点：1）具有相似的、富集半胱氨酸胞外结构域；2）胞浆区具有同源性死亡结构域（deathdomain,DD）TNFR分为两种亚型：1）TNFR-I型，具有DD，介导刺激和凋亡2）TNFR-II型，缺乏DD，介导刺激效应,也能介导凋亡效应。,TNF诱导凋亡主要机制：TNF-TNFR-I，TNFR-I形成同三聚体，DD/TNFR-I与DD/TRADD（TNFreceptor-associateddeathdomain）交联;DED/TRADD与DED/上游Caspase结合；Caspase-8寡聚体下游Caspase细胞凋亡,Fas介导

32、的凋亡途径Fas-FasL，Fas分子形成同三聚体；DD/Fas与DD/适应蛋白结合；DED/适应蛋白与DED/上游Caspase结合；caspase-8寡聚体下游caspases细胞凋亡。死亡诱导信号复合体（DISC）：死亡受体适应蛋白caspase-8,三、Caspases的作用底物ICE亚家族：caspase-1，-4，-5；主要辅助促炎症反应；Ced-3亚家族：caspase-2，-3，-6-10；主要参与细胞凋亡过程。参与凋亡的机制：1.灭活细胞凋亡抑制蛋白细胞凋亡时，caspase对ICAD进行剪切，使之失活，CAD游离，进入细胞核内降解DNA。ICADDFF45,2.以结构蛋白为

33、靶子，导致细胞结构解体细胞凋亡时，caspase在单一位点剪切核纤层蛋白，导致核板塌陷及染色质浓缩。3.以效应蛋白为靶子，导致其调节和效应结构域解体Caspase作用于DNA修复、mRNA拼接及DNA复制相关蛋白；还可剪切某些激酶并使之激活，参与细胞凋亡中的膜重建和发泡等。,第三节线粒体相关的细胞凋亡信号途径细胞游离系统cell-freesystem线粒体在细胞凋亡中的作用：DNA的裂解依赖线粒体的存在；ATP存在时，caspases的活化依赖细胞色素C自线粒体释放;线粒体膜上存在许多调控凋亡分子.,一、细胞凋亡过程中线粒体跨膜电位的变化生理状况下，线粒体跨膜电位表现为内负外正的电化学梯度。膜

34、外室含有cytoC、caspases前体、乙酰化激酶2和凋亡诱导因子（AIF）等。线粒体膜通透性转运孔MMP：定位于线粒体内外膜之间的一组蛋白复合体（VDAC、ANT及PSR和亲环素D）。,C态ANT导致MMP开放，m态ANT导致MMP关闭；MMP的持续开放和关闭，则分别诱导和抑制细胞凋亡。,二、MMP开放导致线粒体释放caspases活化物Apaf-1结构特点：1）caspase结合结构域（CARD）；2）核苷酸结合域；3）C端结构域（WD-40重复序列）；Apaf-1/cytoC复合物与ATP/dATP结合;Apaf-1寡聚体形成并激活;CARD/Apaf-1结合多个caspase-9前体

35、;caspase-9活化-诱导下游caspases级联活化。将CytoC、Apaf-1和caspase-9前体组成的全酶复合物称为“凋亡体(apoptosome)”。,CytoC是线粒体呼吸链的重要组成成分，线粒体内cytoC的耗竭，将破坏呼吸链的电子转运，进而致使ATP生成受阻、ROS产生，从而诱导细胞坏死。CytoC的释放导致细胞不同的结果：1）有充足cytoC的细胞，能维持电子转运，氧消耗ATP生存保持正常水平，MMP的破坏诱导caspases活化，导致细胞凋亡；,2）当存在大量内源性caspase抑制剂的细胞，cytoC的释放不能诱导caspase依赖的细胞凋亡，而将破坏电子转运，致使

36、氧消耗及ATP生存减少，导致细胞坏死。由此，提出了ATP减少与否是决定细胞发生坏死还是凋亡的重要因素。,其它的凋亡效应因子：1）凋亡诱导因子AIF：细胞凋亡时，AIF自线粒体释放即转运到细胞核内，刺激DNA降解和染色质凝集；不依赖caspase和AIF的氧化还原酶活性；AIF本身并无DNA酶活性；2）Smac/DIABLO：通过抑制IAP（凋亡抑制蛋白）活性参与细胞凋亡；3）核酸内切酶G：能诱导核小体DNA降解，无需caspase的参与。,第四节内源性细胞凋亡抑制物和Bcl-2基因家族一、内源性细胞凋亡抑制物1.Caspase-8（FLICE）抑制蛋白（FLIP）V-FLIP家族蛋白与DED/

37、FADD相互作用，进而抑制Fas介导的细胞凋亡；c-FLIP，FLIPL和FLIPS都能通过DED、FADD、caspase-8甚至caspase-10相互作用，从而特异地抑制死亡受体介导的细胞凋亡。,2.SODD（silencerofdeathdomain）与TNFR-I的DD相关；维持TNFR-I的无活性单体状态；,3.IAP（inhibitorofapoptosisprotein）杆状病毒中，一组含一个或多个BIR（baculovirusIAPrepeat）结构域的胞内蛋白，具有caspases抑制活性；NIAP（神经元凋亡抑制蛋白）IAP分子通过与caspase-3、7和9相互作用，抑

38、制caspases活性4.Survivin独特的细胞凋亡抑制蛋白。,二、Bcl-2家族的结构特点及其与功能的关系Bcl(Bcelllymphoma)2基因易位t(14,18)Bcl-2同源蛋白：凋亡抑制蛋白Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-w、Bcl-G等凋亡诱导蛋白Bax、Bad、Bak、Bcl-B、Bcl-XS等病毒产物：E1B-19K、BHRF-1,Bcl-2家族成员主要两大结构域：羧基端跨膜结构域（transmembraneregion,TM）是Bcl-2定位于细胞内膜所必需的；Bcl-2的功能完整性取决于其亚细胞膜定位。Bcl-2同源结构域（Bcl-2homology,BH）是Bcl

39、-2家族各成员之间或Bcl-2家族成员和其他蛋白相互作用的重要分子基础。Bcl-2是一种细胞内膜蛋白，主要定位于线粒体、内质网及核膜。,三、Bcl-2家族蛋白的活性调节和效应机制Bcl-2磷酸化位点：主要位于BH4与BH3之间。凋亡调控效应:1)通过影响多种凋亡相关的变化，包括细胞氧化还原状态、浆膜的变化、细胞内离子以及抑制caspases-3的活化；2)Bcl-2蛋白定位移位到线粒体膜，调节膜通透性,抑制MMP开放，阻止线粒体内促凋亡活性物释放。,第五节细胞凋亡和恶性肿瘤一、凋亡抑制基因bcl-2和恶性肿瘤B细胞淋巴瘤，染色体易位t（14，18），bcl-2基因受免疫球蛋白基因增强子的影响而

40、高表达；高水平Bcl-2表达1）与急性白血病预后差相关；2）明显增加对化疗药物的耐受性；Bcl-2高表达单独存在不足以导致肿瘤的发生，还有赖于其他事件的参与。,Bcl-2可以导致滤泡状B淋巴细胞增生甚至高程度的单克隆淋巴瘤，但从多克隆淋巴增生发展为单克隆淋巴瘤，其他癌基因或抑癌基因的改变起到了十分重要的作用。c-myc基因作为一个“经典”的癌基因，其生物学功能极其复杂和重要，促进细胞周期的进展；能诱导细胞凋亡，发挥细胞生长的“负性”调控物效应。Bcl-XL在某些肿瘤中高表达。,二、凋亡活化基因p53和恶性肿瘤p53基因:防止潜在恶性细胞生长（DNA损伤、端粒磨损、癌基因活化、低氧）MDM-2:

41、1)具有E3连接酶活性，诱使p53从细胞核移位到胞浆并降解；2)能抑制p53的转录功能；3)减少p53的乙酰化，导致p53的功能受抑。,在P53和MDM-2之间形成一个自身调节的反馈环，有效控制p53的过度活化，确保细胞的正常生长。MDM-2表达的直接抑制、p53和MDM-2的翻译后修饰、MDM-2抑制蛋白的表达、p53或MDM-2亚细胞定位的调节等，都将参与调节MDM-2诱导的p53降解。,活化状态的p53能诱导多种细胞学反应（细胞的分化、衰老、DNA修复及血管生成抑制等），其中阻遏细胞生长和诱导细胞凋亡的研究最为深入。p53靶基因，尤其是参与p53介导的细胞凋亡相关基因的识别，是目前有关p

42、53功能研究的重要领域。,p53能通过与p53阴性反应元件（PNRE）相互作用，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，并能诱导具有MMP功能的促凋亡蛋白的表达（Bax、NOXA等）；p53蛋白诱导产生ROS的线粒体酶的表达；p53诱导死亡受体Fas和胞质蛋白Apaf-1的表达。细胞凋亡信号途径：p53依赖的凋亡信号途径p53非依赖的凋亡信号途径,三、其他凋亡相关蛋白和恶性肿瘤抑制细胞凋亡的异常融合蛋白：1.Bcr-abl蛋白染色体易位t（9；22），Bcr-abl融合基因表达，产生p210Bcr-abl蛋白质，进而诱导细胞转化、降低细胞凋亡速率、提高对各种凋亡诱导剂的高度耐受、调节Fas介导的凋亡（

43、抑制作用）。,2.PML-RARa蛋白染色体易位t（15；17），产生融合基因PML-RARa，表达PML-RARa融合蛋白，进而阻止APL（急性早幼粒白血病）细胞的分化，抑制细胞凋亡。体外研究，PML-RARa能明显抑制U937细胞凋亡。PML-RARa蛋白能与野生型PML形成异二聚体，阻碍了野生型PML蛋白参与多种因素诱导的细胞凋亡。,第六节细胞凋亡干预和肿瘤的治疗拓扑异构酶抑制剂VP-16：诱导拓扑异构酶与DNA形成断裂复合物，导致DNA损伤，诱导细胞凋亡；微管毒性剂紫杉醇：通过使Bcl-2磷酸化，促进细胞凋亡；糖皮质激素：通过cAMP介导细胞凋亡，而且还能调节凋亡相关基因促进细胞凋亡;,一、以诱导肿瘤细胞凋亡为目标的基因治疗策略在肿瘤细胞内，导入凋亡活化基因，