8.1 高效液相色谱法的发展8.2 反相高效液相色谱8.3 正相高效液相.ppt

1、,色谱分析,应用化学系,应用化学系孙敏2012.3.27,高效液相色谱,第八章高效液相色谱HighPerformanceLiquidChromatography,8.1高效液相色谱法的发展8.2反相高效液相色谱8.3正相高效液相色谱8.4离子色谱8.5离子对色谱8.6体积排阻色谱8.7疏水作用色谱8.8胶束液相色谱8.9亲和作用色谱,知识要点,了解高效液相色谱的出现和优点；了解高效液相色谱的分类；掌握高效液相色谱系统的组成部分；掌握反相色谱的含义、分离机理、固定相和流动相组成等。,8.1高效液相色谱法的发展ThedevelopmentofHPLC,8.1.1古典液相色谱8.1.2高效液相色谱的

2、出现8.1.3高效液相色谱的组成8.1.4高效液相色谱柱8.1.5高效液相色谱与古典相色谱、气相色谱的比较,8.1.1古典液相色谱,液相色谱的出现1906年，俄国植物学家茨维特(Tsweet)用碳酸钙填充竖立的玻璃管，以石油醚洗脱植物色素的提取液，经过一段时间洗脱之后，植物色素在碳酸钙柱中实现分离，由一条色带分散为数条平行的色带。研究了叶绿素在100多种吸附剂上的吸附现象，提出了色谱法的概念。,8.1.2高效液相色谱的出现,古典液相色谱，由于柱效低而未能发挥出潜能。气相色谱在20世纪60年代初高速发展，但由于对高分子量的、热稳定性差的物质不适用，人们又将注意力转向了液相色谱。20世纪70年代，

3、液相色谱获得了高速的发展，出现了高效液相色谱。高效液相色谱的特点：1)高压、高柱效、高流速、高灵敏。2)能够分析高沸点、热不稳定有机物。,1.仪器组成部分1）高压输液泵2）进样系统3）色谱柱4）检测器2.软件操作系统,8.1.3高效液相色谱的组成,Agilent1100MS,Agilent1200双检测,3.高效液相色谱分离过程中的两相1）流动相作为洗脱剂2）固定相作为分离场所,8.1.4高效液相色谱柱,1.高效液相色谱柱色谱的心脏,2.色谱固定相种类多样载体表面修饰官能团,反相色谱固定相,正相色谱固定相,阴离子色谱固定相,阳离子色谱固定相,3.高效液相色谱柱的装填多采用“匀浆法”溶剂匀浆后气

4、动泵高压装填,8.1.5高效液相与古典液相色谱、气相色谱的比较,1.高效液相色谱和古典液相色谱的比较,2.高效液相色谱和气相色谱的比较,第八章高效液相色谱HighPerformanceLiquidChromatography,8.1高效液相色谱法的发展8.2反相高效液相色谱8.3正相高效液相色谱8.4离子色谱8.5离子对色谱8.6体积排阻色谱8.7疏水作用色谱8.8凝胶色谱,8.2反相高效液相色谱Revised-phaseHPLC,8.2.1高效液相色谱的分类8.2.2反相色谱的含义8.2.3反相色谱的分离机理8.2.4反相色谱柱和流动相8.2.5反相色谱的应用,8.2.1高效液相色谱的分类,

5、按照分析物在固定相与流动相间作用机理的不同，主要分为9类：1、反相色谱6、亲和色谱2、正相色谱7、疏水作用色谱3、离子色谱8、胶束色谱4、离子对色谱9、电色谱5、体积排阻色谱,8.2.2反相色谱的含义,1、反相高效液相色谱以强疏水性的填料作固定相，以与水混溶的有机溶剂或它们的混合物作为流动相的液相色谱。2、如在硅胶上键合C18或C8烷基的非极性固定相，以极性强的水、甲醇、乙腈等作为流动相的高效液相色谱。3、反相色谱模式在HPLC中应用最广，约占色谱应用的70%-80%，可以分离多种混合物。,8.2.3反相色谱的分离机理,1、疏溶剂理论完全或部分疏水性溶质分子受到极性溶剂的排斥而被非极性烃类固定

6、相吸引，溶质分子和非极性固定相之间的作用是靠弱的色散力。2、组分在两相之间达到分配平衡时的平衡常数又称分配系数，K=cs/cm；cs和cm分别是组分在固定相和流动相中的浓度。,3、分配系数的意义：K值的大小表明组分与固定相分子间作用力的大小。K越大，组分与固定相的亲和力越大，保留时间越长，出峰速度越慢。4、分配系数的影响因素：温度、压力、溶质组分的性质、固定相和流动相的性质。5、反相色谱中各组分如何实现分离?,C18反相色谱柱，分6个稠环化合物,相同色谱条件下，不同组分的分配系数的差异是实现色谱分离的先决条件，相差越大，越易实现分离。极性组分先出峰，非极性组分后出峰。,8.2.4反相色谱柱和流

7、动相,反相色谱最关键的部分-反相色谱柱1、目前以硅胶基质的反相色谱柱为主1)常规硅胶键合C18，C8等填料柱，不利于分离碱性物质。2)高覆盖量的反相柱，有较强的保留。3)高稳定性的反相柱，耐酸碱性强。4)高纯硅胶反相柱，基质纯度高，金属杂质少，残余硅羟基量低且酸性低，对碱性分析物的分离效果好。,2、常见的硅胶基质反相色谱填料,碳八,碳十二,碳十八,苯基,3、其它无机氧化物基质的反相色谱柱1）硅胶基质反相柱缺陷：碱性流动相条件（pH8）易溶解。2）二氧化钛、二氧化锆或氧化铝等无机氧化物做基质的反相柱可以在碱性条件使用。3）缺点：比硅胶的比表面积小，固定相键合量低，分离能力受到限制。4）近年来，将

8、耐碱性氧化物的纳米粒子自组装到多孔硅胶表面，获得耐碱性的无机氧化物/硅胶核壳型色谱基质，制备了反相柱。,杂化硅胶,表面多孔层硅胶,4、聚合物基质的反相色谱柱1）苯乙烯-二乙烯基苯的共聚物、聚丙烯酸酯类、聚乙烯醇类以及苯乙烯与它们的共聚物等。自身具有疏水性能够直接作为反相色谱柱填料。在聚合物基质上化学修饰C18，C8等烃类分子获得反相色谱柱。2）优点是耐酸碱，尤其适用于分离生物分子，被生物样品污染后可以用氢氧化钠清洗。3）缺点是耐有机溶剂差，易溶胀。,5、反相色谱的流动相1）极性溶剂或是它们的混合物例如：水（或缓冲盐溶液）、甲醇、乙腈2）有机溶剂纯度色谱纯99.99%水纯度要求高二次蒸馏水或多次

9、离子交换水3）常用混合流动相甲醇-水或乙腈-水，调节比例，使极性不同的组分获得分离，极性组分先出峰，非极性组分后出峰。4）流动相中甲醇或乙腈增加，洗脱能力增强，各组分保留时间减小。,甲醇-水（80:20,V/V）,甲醇-水（85:15,V/V）,8.2.5反相色谱的应用,1、反相色谱的应用十分广泛反相色谱是高效液相色谱最重要和最为普遍的一种模式，它的应用约占高效液相色谱的70%-80%，应用非常广泛。2、一般小分子有机物药物，农药；氨基酸，低聚核苷酸；多肽，蛋白质等。,第八章高效液相色谱HighPerformanceLiquidChromatography,8.1高效液相色谱法的发展8.2反相

10、高效液相色谱8.3正相高效液相色谱8.4离子色谱8.5离子对色谱8.6体积排阻色谱8.7疏水作用色谱8.8凝胶色谱,8.3正相高效液相色谱Normal-phaseHPLC,8.3.1正相高效液相色谱的概念8.3.2正相色谱的固定相8.3.3正相色谱的流动相8.3.4正相色谱的分离机理8.3.5正相色谱的应用8.3.6正相色谱与反相色谱的比较,8.3.1正相高效液相色谱的概念,1.正相色谱是指以亲水性的填料作为固定相，以疏水性溶剂作为流动相的液相色谱2.固定相如：硅胶、硅胶上键合羟基、氨基或氰基的极性固定相3.流动相如：正己烷、正己烷-异丙醇或正己烷-乙醇,8.3.2正相高效液相色谱的固定相,1

11、、硅胶2、羟基硅胶3、氨基硅胶4、氰基硅胶,极性由小到大顺序：氰基硅胶硅胶羟基硅胶氨基硅胶,8.3.3正相色谱的流动相,1、正相色谱流动相是相对于固定相极性较弱的有机溶剂或是有机溶剂的混合物。常以正己烷或环己烷做基础溶剂，为了洗脱极性较强的溶质，加入极性溶剂，如异丙醇、乙醇、二氯甲烷、四氢呋喃等。1)分极性弱溶质的流动相:正己烷-异丙醇或正己烷-乙醇2)分极性强溶质的流动相:正己烷-四氢呋喃2、正相色谱流动相要求无水，流动相中微量的水会吸附到正相固定相上，从而减弱正相柱的极性，降低分离性能；破坏色谱柱。,8.3.4正相色谱的分离机理,1、正相色谱的分离机理1）溶质和固定相间的极性作用，如偶极-

12、偶极作用、偶极-诱导偶极作用。极性溶质与极性固定相间存在偶极-偶极作用；弱极性或非极性溶质如多环芳烃与极性固定相间存在偶极-诱导偶极作用。2）溶质和固定相间的氢键作用、静电作用等。2、溶质极性越强与固定相的作用越大，保留越强，需要极性较强的流动相进行洗脱，流动相中极性组分的含量增加。,8.3.5正相色谱的应用,1、反相色谱中疏水性物质保留太强，亲水性强的物质没有保留，导致分离困难。2、正相色谱在极性化合物的分离方面有自己的优势，而且可以选择不同极性的固定相，能够补充反相色谱难以分离分析的物质。3、主要应用于分离类酯化合物、甾醇类、苯甲酸酯类、脂肪酸等。,8.3.6正相色谱与反相色谱的比较,第八

13、章高效液相色谱HighPerformanceLiquidChromatography,8.1高效液相色谱法的发展8.2反相高效液相色谱8.3正相高效液相色谱8.4离子色谱8.5离子对色谱8.6体积排阻色谱8.7疏水作用色谱8.8凝胶色谱,8.4离子色谱IonHPLC,8.2.1离子色谱的概念8.2.2离子色谱的原理8.2.3离子色谱的组成8.2.4离子色谱柱8.2.5离子色谱流动相8.4.6离子色谱的应用,8.4.1离子色谱的概念,离子色谱是高效液相色谱的一种，是分析阴离子和阳离子的一种液相色谱方法。8.4.2离子色谱的原理离子色谱基本原理离子色谱的分离机理主要是离子交换样品离子X，流动相离子

14、Y，固定相的作用位点R阳离子交换：阴离子交换：,8.4.3离子色谱的组成,1、离子色谱系统IC系统的构成与HPLC相同，由流动相传送部分、进样装置、分离柱、检测器4个部分组成，在需要抑制背景电导的情况下通常还配有抑制器。2、离子色谱的最重要的部件是离子色谱柱。,8.4.4离子色谱柱,1、阳离子色谱柱弱阳离子色谱柱离子交换基团：羧基强阳离子色谱柱离子交换基团：磺酸基2、阴离子色谱柱弱阴离子色谱柱离子交换基团：氨基强阴离子色谱柱离子交换基团：季胺3、硅胶基质柱不耐酸碱，有机聚合物基质柱为主，如聚苯乙烯微球修饰阴、阳离子交换基团的填料柱。,8.4.5离子色谱流动相,样品离子的置换离子的溶液，为提高灵

15、敏度，洗脱剂中的置换离子应具有很高或很低的摩尔电导。1）阴离子交换模式中，大分子量的有机酸和它的盐有低的电导；无机碱(OH-)有高的电导。2）阳离子交换模式中，大分子量的季铵盐有低的电导，但强烈吸附在交换树脂上；无机酸(H+)有高的电导。,8.4.4离子色谱的应用,离子色谱分离1）无机、有机阴阳离子；2）环境科学、生命科学、食品、工业等领域。,第八章高效液相色谱HighPerformanceLiquidChromatography,8.1高效液相色谱法的发展8.2反相高效液相色谱8.3正相高效液相色谱8.4离子色谱8.5离子对色谱8.6体积排阻色谱8.7疏水作用色谱8.8胶束液相色谱8.9亲和

16、色谱,知识要点,掌握离子对、体积排阻、疏水作用、胶束液相色谱和亲和色谱的含义；掌握离子对、体积排阻、疏水作用、胶束液相色谱和亲和色谱的分离机理、固定相和流动相组成，以及应用对象。,8.5离子对色谱,8.5.1离子对色谱的概念8.5.2反相离子对色谱8.5.3反相离子对色谱的应用,离子对色谱的概念用正相或反相色谱柱分离离子和中性化合物混合物的方法。正相或反相系统分离分析离子的方法分为正相离子对色谱和反相离子对色谱。,反相离子对色谱分离过程：以反相色谱固定相如ODS作为填料，流动相为含有对离子（B-）的溶液，当样品进入色谱柱后，样品离子（A+）与对离子相互作用生成中性化合物（AB），在色谱固定相上

17、被保留。,流动相反相离子对色谱常用流动相是甲醇-水、乙腈-水，增加有机溶剂的含量，色谱保留减弱。在增加有机溶剂时应该考虑离子对试剂的溶解度。流动相的酸度会影响样品离子的和对离子的解离，从而会影响保留值。表8-7反相离子对色谱流动相酸度的选择,离子对试剂离子对试剂的种类、大小、浓度都会对分离有很大的影响。表8-8反相离子对色谱的离子对试剂反相离子对色谱的应用分离分析无机阴、阳离子，生物碱，维生素，抗菌素，药物等，应用于生化、石油、化工等领域。,8.6体积排阻色谱,8.6.1体积排阻色谱的含义8.6.2体积排阻色谱的发展过程和应用领域8.6.3体积排阻色谱的分离机理8.6.4体积排阻色谱的固定相和

18、流动相,体积排阻色谱的含义是快速分离不同分子量混合物的色谱方法，可以给出各个组分的大概分子量及其分布。,体积排阻色谱的发展过程和应用领域20世纪60年代末Porath等使用一种低交联度的多孔聚合物作固定相，分离了水溶性的不同分子量的聚合物，被称作“凝胶过滤色谱（GFC）”。只适用于水溶性物质的分离。后来出现了凝胶渗透色谱，用有机溶剂中溶胀性较小的多孔树脂作为固定相，有机溶剂作为流动相测定出聚合物的分子量分布，叫作“凝胶渗透色谱（GPC）”。体积排阻色谱包括了凝胶过滤色谱和凝胶渗透色谱，分离原理相同，能够快速测定高聚物分子量分布，也是分离纯化蛋白质的有用方法。,体积排阻色谱的分离机理主要依靠分子

19、的体积排阻，样品组分与固定相之间原则上不存在相互作用，色谱柱固定相是具有不同孔径的多孔凝胶，直径小于凝胶孔径的分子进入固定相中获得保留，而直径大于凝胶孔径的分子仅随流动相在固定相之间的空隙内不在固定相中形成保留。所以大的样品分子保留时间短，洗脱体积小；而小的分子保留时间长，洗脱体积大。图8-8体积排阻色谱的洗脱曲线VR=V0+KSVIKS：体积排阻色谱的分配系数0-1,体积排阻色谱的固定相和流动相色谱填料的孔径和样品分子的大小和分布相适应，目前主要有亲水性凝胶、聚苯乙烯凝胶和无机填料。流动相用缓冲溶液、可溶解聚合物的有机溶剂（如四氢呋喃）。,8.7疏水作用色谱,8.7.1疏水作用色谱的概念8.

20、7.2疏水作用色谱的分离机理8.7.3疏水作用色谱的固定相8.7.4疏水作用色谱的色谱条件,疏水作用色谱的概念1961年出现，1973年被正式命名。(hydrophobicinteractionchromatography，HIC)利用样品中各组分与固定相具有不同的疏水作用的性质进行分离的方法，主要分离对象是蛋白质。,疏水作用色谱的分离机理固定相表面为弱疏水性，比反相色谱用的固定相低几十到几百倍，流动相为高离子强度的盐溶液（高极性）。蛋白质分子的疏水性基团和固定相的疏水基团作用而被保留。当用流动相洗脱时逐渐降低流动相的离子强度，洗脱能力增强。蛋白质分子按其疏水性大小被依次洗脱出来，疏水性小的先

21、流出。,疏水作用色谱的固定相（1）把排阻色谱固定相进行疏水基团的化学改性，用于疏水作用色谱固定相。（2）硅胶基质键合各种弱疏水基团的固定相先键合亲水性聚合物，再修饰上疏水基团（疏水性由弱到强：羟丙基、丙基、苄基、异丙基、苯基和戊基）键合聚酰胺键合长链醚键合聚醚（如聚乙二醇）,影响疏水作用色谱的色谱条件固定相的疏水性比反相色谱的低10-100倍流动相的离子强度离子强度越大，洗脱能力越弱，色谱保留越强酸度中性缓冲溶液温度,8.8胶束液相色谱,8.8.1胶束液相色谱的概念8.8.2胶束液相色谱的分离机理8.8.3胶束液相色谱的表面活性剂8.8.4胶束液相色谱的应用,胶束液相色谱的概念用高于临界胶束浓

22、度的表面活性剂溶液作为流动相，被分离溶质在固定相和胶束相以及水相之间进行分配。胶束液相色谱的分离机理,胶束液相色谱所用表面活性剂,胶束液相色谱的应用药物分析和环境监测有机金属化合物、无机阴离子、蛋白质和药物分子。分析痕量甲基砷酸、甲基锡、丁基锡、苯基锡等。,8.9亲和液相色谱,8.9.1亲和色谱的概念8.9.2亲和色谱的分离机理8.9.3亲和色谱的应用,生物分子能够区分结构和性质非常接近的其它分子，选择性地与其中某一种特定分子相结合，这种特异性相互作用成为亲和作用。包括抗体-抗原、酶-底物、激素-受体之间的特异性识别。主要还是静电作用、氢键作用等。,亲和色谱是一种色谱分析方法，是一种利用固定相的可逆结合特性来分离分子的色谱方法。亲和色谱在凝胶过滤色谱柱上连接与待分离的物质有一定结合能力的分子，并且它们的结合是可逆的，在改变流动相条件时二者还能相互分离。亲和色谱可以用来从混合物中纯化或浓缩