02 Northern Blot技术Northern-Blot印迹杂交

1、 加 入3.6ml 10 X Denaturing Gel buffer,轻轻振荡混匀。注意尽量遵免产生气泡。G) 将捻肤倒入制肤扳中， 插 上梳子。 注： 肤 的辱度不 能超 过0.5cm 。肤在室温下完全凝固后，将胶转移列电泳槽中， 加入1 XMOPS Gel Running buffer 盖 过肤 面 约1cm。检杏点样孔。4. RNA 样品的制备： 在RNA 样品中加入 3 倍体尔的formaldehyde load dye和 迨 当 的EB。 混匀后， 65C 15 m in。 短 暂低 速窝心 后， 立 即 放 置 于冰上 5 min。5. 电泳：将 RNA 样品小心加列 点样孔

2、中， SV/cm下 进行电泳（在电泳过程中， 每 隔30 m in 短 暂停止电泳，取出肤，混匀丙极的电泳液后继续电 泳），当肤中的涣纷蓝接近肤的边缘时终止电 泳；紫外灯下，检验电泳情况，并用尺子测 量18S、 28S、 涣纷蓝 列 点 样孔的 距 离 （ 注意不要让肤在紫外灯下曝光太长时间）。6. 转膜：(J) 用3/o双 氧水浸泡真 空转移仪 ， 用RNAZ ap擦洗多 孔 渗 水 屏和塑 胶 屏， 用DEPC 水 冲 洗二次。连接真空泵和真空转移仪，剪取一块迨当大小 的膜， 在Tran sf er buffer 浸湿 5 min后， 放 置在多孔渗水屏的迨各位置。盖上塑胶屏，盖上外框，扣

3、上锁，将肤的多余部分切除，切后的胶四边缘要能盖过塑胶屏孔， 并 至少 盖过边缘约2mm ,以防止漏气。将肤小心放置在膜上，膜与胶间不能有气泡。7,打 开真 空 泵， 使 压强 维持在50-58 mbar;立 即将tra nsfer buffe r加列肤 面 和 四 周。每 隔10min在肤上加1 ml transfer buffer,转移2h。Gel Running buffer8,转膜后将膜于1 XMOPS中轻轻 泡洗10 sec (去残余肤和盐）。9,用吸水纸吸取膜上多余的液体后，将膜置于UV 交联仪 中旬 动 交联。10,将肤和紫外交联后的膜，在紫外灯下检测 转移效率。（遵免太长的紫外曝

4、光时间）。11 ,将膜在-20 C保存。12. 探针的制备：Random Primer2I(J) 在1.5ml 离 心 管 中配制以 下反 应 液：模扳DN A(25 ng)1I;14夭 茼 水 11 I ;总体 :I 。(2) 9 5 C加热3 min后， 迅速放置 于冰 冷 却 5 min。在离心管中按下列顺序加入以下溶液： 10 X Buffer2.5I dNTP Mixture2.5IExo-free Kienow Fragment111 TBq/mmola-32PdCTP5I1I混匀 后( 25ul),37 C下反 应30 m in。 短暂 窝心，收集溶液到管底。 65 C 加热5

5、min 使酶失活。13. 探针的纯化及比活性测定：凝 胶加入(J)准备凝胶 ： 将 l g30 mlDEPC 水 中 ， 浸以 除泡过夜。 用DEPC 水 洗涤膨胀的凝肤数次，去可溶解的 葡 聚糖。换 用新 配的。 取1 m l 的 注射 器， 去除内 芯推扞， 将注射 器底部用硅化的玻璃纤维麦住，在注射器中装填12Sephadex G-50。 将注射 器放 入一 支15ml 窝心 管 中， 注射 器把手架在窝心 管口上。1600 g 窝心 4 min,凝胶压紧后，Se phadex G-50 凝胶 悬 液， 重 复 此步 直 至凝 肤 柱 高 度 达注射 器补 加0 .9 m l 刻 度 处

6、。100I ST E缓 冲 液洗柱， 1600 g 窝心 4 m in 。 重复3次。 倒掉 窝心 管中的溶液后， 将一 去盖的1.5ml 窝心管置 于15 ml 管 中， 再 将装填了 Sephadex G-50 凝肤的 注射 器插 入 离 心 管 中， 注射 器口对准1.5ml离心管。 将标记的DN A 样品加入25 I STE,取 出0.5 I点样 于 D ES-paper 上， 共余 上 样于层析 柱 上。(1) 1600 g 窝心DNA将流出梭收集在去盖的 离 心 管中， 而 未林 入DN A的 dN TP 则保 留在层析 柱中。取0.5 I 己 纯化的探针 点样 于D E8- pa

7、per测比活性（忒利比活要求： 106cpm / m l )。14,预杂交：(J) 将预 杂交液在杂交炉中68C预 热， 并 璇 涡使未溶解的物质溶解。 加入迨量 的ULRAhyb 列 杂交管 中(100 cm 2加入10m l U LRAhyb 杂交液）， 4 2 c 预 杂交4 h。15,探针变性：(J) 用10 mMED T A将探针稀释10倍。(2) 9 0 C热处 理稀释后探针10 min,立即放置于冰上5 min。短暂窝心，将溶液收集列管底。16. 杂交：(J) 加 入0.5 ml ULTRAhyb 列 变性的探针中， 混匀后，将探针加列预杂交液中。(2) 4 2c 杂交过夜( 1

8、4,._24 h),杂交完后，将杂 交液收集起 来 于 -20 C保存。17. 洗膜 ：膜 面年加入(100cm 2洗膜20 min 丙次。20 ml 洗膜溶液）， 4 2 c 摇 动18. 曝光：将膜从洗膜液中取出，用保鲜膜包住， 以防止膜干燥；检杏膜上放射性强度，估计曝 光时间， 将X 光底 片 覆 盖与膜上， 曝 光后 冲 洗X光底片，扣描记录结果。19. 去除膜上的探针： 将200 ml0.1/o SDS( DEP C水 配制） 煮 沸后， 将膜放入， 室 温下让SDS 冷 却 到 室 温， 取 出膜 ， 去除 多 余 的 液体， 干燥后，可以保存几个月。20. 杂交结果RNA Blot on NitrocelluloseRNA Sepa.1-a.tion by GelEReveals RNA of InterestlectrophoresisDetect Probe (on X- ra y fi lm )_ _Label with Specific Nucleic Acid P1 be:二墨l_.上9.5754.4t.24.-占