鸡蛋中溶菌酶的提取

1、鸡蛋中溶菌酶的提取，纯化及纯度鉴定李莹姝蒋华云*（南京师范大学生命科学学院，南京 ）摘要：从蛋清中用724弱酸性阳离子交换树脂提取溶菌酶，然后用硫酸铵溶液洗脱，盐析得到溶菌酶。用葡聚糖凝胶层析（SephadexG-75）纯化溶菌酶，收集峰值处样品。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳鉴定个步骤留样及所得溶菌酶样品的纯度。溶菌酶得率为0.0474mg/100ml（0.03g/kg）；葡聚糖凝胶层析过程纯化样品得到了洗脱峰曲线，但未能收集到峰值处样品；电泳结果显示在纯化过程中溶菌酶纯度不断升高。本实验溶菌酶得率较低，提取工艺有待改进，需进一步减少样品损失；层析过程需进一步熟练掌握，以更

2、好达到纯化效果。关键词：溶菌酶；离子交换树脂，凝胶层析；SDS-PAGEExtraction, purification and purity of Egg lysozymeYings LiHuay Jiang*(College of Life Science, Nanjing Normal University, Nanjing , China)Abstract:From egg white, with 724 weak acid cation exchange resin extraction of lysozyme, and then eluted with ammonium sulfa

3、te, salting to be lysozyme. With dextran gel chromatography (SephadexG-75) purified lysozyme, the peak of the sample collection. By SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) electrophoresis and identified steps to stay kind of purity of the samples from lysozyme. Lysozyme yield 0.0474mg/100ml (0.03g/kg); de

4、xtran gel chromatography purified samples obtained during elution peak curve, but failed to collect samples at the peak; electrophoresis showed that the purification process of lysozyme enzyme purity rising. In this study, lysozyme was the low rate of extraction process could be improved, the need t

5、o further reduce sample losses; chromatography process needs further proficiency in order to better achieve purification.Key words:lysozyme, Ion exchange resin, Gel chromatography, SDS-PAGE溶菌酶( Lysozyme , 1,4N溶菌酶) 是一种专门作用于革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖的-1,4- 糖苷键的水解酶, 因而又称为胞壁质酶或者N- 胞壁质聚糖水解酶。溶菌酶在临床上是有效的消炎剂, 在食品防腐和基因工程

6、等方面也有广泛的应用。1 2溶菌酶来源广泛, 人、动物、植物和微生物中均有发现, 其中鸡蛋清中含量较高, 因此, 工业生产溶菌酶常以鸡。蛋清为原料鸡蛋清的溶菌酶是研究得最清楚的一种溶菌酶3，其化学性质稳定，纯品为白色或微黄色结晶体，易溶于水，不溶于丙酮、乙醇，是一种分子量在1415kD，等电点pH 值在11.0 左右，最适效应温度在50，最适pH 值为6.07.0 的碱性球蛋白。它的生物化学功能是催化某些细菌细胞壁多糖的水解，从而溶解这些细菌的细胞壁。溶菌酶的抗菌及抗病毒活力与pH 值有关，在酸性介质中，活力显著增强。当前, 溶菌酶的制备有多种方法，最常用的是离子交换树脂吸附法4。溶菌酶的用途

7、很多，由于它本身是一种天然蛋白质，无毒性，可以作为防腐剂、保鲜剂。在医药上，溶菌酶具有多种药理作用，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效，广泛应用于临床医学。溶菌酶是基因工程、细胞工程、发酵工程中必不可少的工具酶，国外多用于菌体内容物质的提取，在发酵工业上是一种重要的溶菌剂，用于破坏细胞壁，制备无菌提取液。溶菌酶所具有的广泛用途吸引了国内外众多学者对其进行研究，已发表不少关于溶菌酶的试验报道。1材料和方法1.1材料与仪器新鲜鸡蛋3颗,购自市场；724型酸性阳离子交换树脂；灭菌纱布；1 mol/L NaOH，1 mol/L HCl；蒸馏水（实验室桶装水）；磷酸缓冲液（pH 6.5，0.15M）；10（

8、NH4）2SO4溶液；固体（NH4）2SO4；BaCl2； 12分离胶；4浓缩胶；Tris-甘氨酸电极缓冲液； loading Buffer；标准蛋白Marker ；染色液（考马斯亮蓝G-250）；脱色液（冰乙酸，甲醇）；葡聚糖凝胶（SephadexG-75）；蓝色葡聚糖-2000（2mg/mL）； G-75洗脱液（KCl，HAc）电子分析天平；真空泵；超声振荡器；布氏漏斗，循环水式多用真空抽滤泵；玻璃棒，冰水浴，吸管，普通离心机，高速冷冻离心机；透析袋，磁子，磁力搅拌器，玻璃层析柱（20mm15cm），恒流泵，细滴管，Bio-Rad层析系统设置，部分收集器；水浴锅；Bio-Rad垂直电泳系统

9、（制胶系统、电泳槽）；脱色摇床；可见分光光度计(UV-1100型)；紫外分光光度计；微量移液器；4冰箱；容量瓶；精密pH试纸；等。部分试剂详细配方及配法见附录I1.2实验方法1.2.1阳离子交换法提取溶菌酶树脂预处理：干树脂清水浸泡，使其充分膨胀并除去细小颗粒和较大杂质； 1 mol/L 的HCl浸泡2 h，去离子水洗3次至至近中性；抽滤收集树脂,1 mol/L 的NaOH溶液浸泡2 h，去离子水洗3次至近中性；抽滤收集树脂,加0.15 mol/L、pH 值为65的磷酸缓冲液平衡过夜待用。蛋清制备：将3个新鲜鸡蛋洗净干燥，小端敲一个小洞，大端打一个小孔进气，分离得鸡蛋清，用1 mol/L HC

10、l调节PH到7。过滤前称量烧杯重48.7g，缓慢搅拌用灭菌的两层纱布过滤除去脐带块和碎蛋壳等，蛋清与烧杯总重207.5g，蛋清净重158.8g。用1 mol/L 的HCl 溶液调pH 值至7.0，量蛋清体积为100 ml。在调节PH时蛋清中出现少量白色沉淀，可能为部分蛋白由于局部过酸而变性。吸附：蛋清在不断搅拌下加入抽滤好的724树脂25g（相当蛋清四分之一体积的树脂），冰水浴中磁力搅拌器缓慢搅拌（使树脂全部悬浮在鸡蛋清中，搅拌不能起泡）吸附2.5 h，4静置1.5h。然后3000r/min离心15min分层，收集树脂，回收蛋清（留样A）。去除杂蛋白：收集树脂用去离子水振荡水洗直至洗液澄清（至

11、无白沫为止），吸管轻吸去洗液，以去除杂蛋白。（每洗1次，离心1次，总共3次）冰浴中用等体积的0.15mol/L、pH =6.5的磷酸缓冲液搅拌洗涤15min，抽滤，重复洗三次，注意防止树脂流失。最后一次抽滤滤除树脂水分至干燥。洗脱溶菌酶：树脂中加入35ml（等体积）的10（NH4）2SO4溶液搅拌洗脱30 min，抽滤,使溶菌酶从树脂上洗脱下来，重复两次，合并收集洗脱液（留样），洗脱液过滤后，准确量取体积100ml。（留样B）盐析:每83mL洗脱液加32g磨细的固体（NH4）2SO4，本实验中总量为38.55g。缓慢加入（NH4）2SO4搅拌待完全溶解后保鲜膜封口，置于4冰箱盐析过夜。透析:待

12、白色沉淀析出，3000r/min离心15 min，收集沉淀，用去离子水将沉淀洗下并全部溶解（4.5ml去离子水），装于透析袋中，于去离子水中透析（冰浴），期间2次更换去离子水，直至用BaCl2检测透析完全。透析装置中加入磁子，于磁力搅拌器中搅拌加快透析速度。去杂质蛋白：取出透析袋中的透析液，用0.1mol/L HCl调整pH4.6，产生少量白色沉淀（留样D），可能为杂蛋白。3000r/min离心10min，收集上清液（留样C 20ul）。浓缩：用PEG-20000浓缩上清液至1.5ml（留样E，20ul，加loading buffer,出现黄色（可能为浓缩时透析袋中渗入了PEG-20000）。

13、5 61.2.2溶菌酶的纯化凝胶溶胀及预处理:取足量SephaexG-75于烧杯中加入20倍体积洗脱液，置室温溶胀2天。反复倾泻去掉细颗粒，并泵脱气；洗脱液用超声脱气完全。测柱床总体（Vt）：取洁净的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。在距柱上端约3cm处作一记号，关闭柱出水口，加入去离子水，打开出水口，液面降至柱记号处即关闭出水口，然后用量筒接住柱中去离子水（水面降至层析玻璃筛板），读出的体积即为柱床总体积Vt=32.5 ml。装柱：在柱中注入已脱气洗脱液（约1/3柱床高度），将溶胀好的凝胶与洗脱液1：3混匀稀释后缓慢倾入柱中，待凝胶沉积约1cm2cm高度后打开出水口，常压平衡，胶面上升到柱记号处

14、则装柱完毕，注意装柱过程中凝胶不能分层。然后关闭出水口，静置过夜，等凝胶完全沉降。过夜后的凝胶柱内颗粒大小分布均匀，松紧一致，填料微孔中无气泡，连接处无死体积。预加样：在胶面上覆盖一层滤纸，接恒流泵，用2倍床体积的洗脱液以0.5ml/min流速平衡柱子，使柱床稳定，期间测定流速是否与预设的一样，并赶走系统中的气泡。用另一支相同的层析玻璃管与层析柱对比得到外水体积为26.5ml。吸去柱上端的洗脱液，打开出水口，使残余液体降至与胶面相切（不要干胶），关闭出水口。用细滴管吸取1.0 mL蓝色葡聚糖-2000沿管壁缓慢加入，打开出水口，等蓝色葡聚糖渗入胶床与胶面相切时，关闭出水口，用少许洗脱液加入柱中

15、，柱上端再用洗脱液充满后用0.5mL/min的速度开始洗脱。收集洗脱液没管1.0 ml。手动记录时间与对应的OD280并绘制曲线。葡聚糖色带狭窄、均匀平整，层析柱性能良好。蓝色葡聚糖洗下来之后，用洗脱液(1倍床体积)继续平衡一段时间。 加样和洗脱：按加葡聚糖的操作方法加入溶菌酶样品溶液1.0 mL，用Bio-Rad层析系统设置洗脱条件，以约0.5mL/min的速度洗脱并收集洗脱液每管0.5 ml。手动记录时间及检测到的洗脱液在A280nm处的吸光值。将收集管编号置于4 冰箱保存.合并洗脱峰内的收集管中的洗脱液。（预先测得记录仪至部分收集器的死体积，出现峰值处的收集管延迟死体积所占的管数才为峰值

16、处样品。）1.2.3溶菌酶纯度鉴定制胶：电泳玻璃板洗净，并把玻璃板在灌胶支架上固定好。将12%的分离胶加入到电泳槽内的两玻璃板之间，到上口约3cm止，再加一薄层蒸馏水填满，赶走气泡，水与胶面分开并且界面清晰。静置20min，将水倒去。将 4%的浓缩胶连续平稳加入至刚刚没过薄板，赶走气泡。迅速从左至右插入梳子，不要留下气泡，静置30min。（取下胶版放入PE手套，加适量蒸馏水4保存）点样：将样品与loading Buffer 1:1混匀。将上述处理的各级分样品和蛋白Marker分别加到点样槽中5ul。接通电源先恒压130V电泳，待各样品从浓缩胶进入分离胶后恒压220V继续电泳，直到溴酚蓝距凝胶边

17、缘5mm是停止电泳，关闭电源。染色及脱色：电泳完毕，将胶板从玻璃板上取下，小心用塑料板开启电泳厚板和薄板，使胶片完整取下。用塑料板切去浓缩胶部分，分离胶放入大的培养皿用考马斯亮蓝R-250摇床染色20min,回收考马斯亮蓝R-250，在培养皿中加脱色液脱色过夜（期间多次更换脱色液直至背景清楚，条带清晰），并对电泳图谱拍照记录。1.2.4蛋白质浓度的测定采用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质浓度。7先用牛血清清蛋白（BSA）及考马斯亮蓝G-250制作蛋白质标准曲线，再根据标准曲线回归方程计算目的蛋白浓度。附：具体组分加样量见附录II2结果和分析2.1凝胶层析纯化图1和图2分别为蓝色葡聚糖和蛋白样品

18、的凝胶层析洗脱图谱。图1层析条件流速0.5ml/min,每2min收集一管。曲线呈明显的尖峰，而且范围狭窄，说明层析柱性能很好。OD280在7、8、9号管出现峰值，根据收集管颜色判断9、10、11号管为峰值，由此推断从经过紫外检测器测得OD值到由部分收集器收集到该样品推迟体积为2ml。图1 蓝色葡聚糖凝胶层析洗脱图谱图2上可以看出，在样品峰值之前有其他的杂蛋白洗脱出来，可能为清蛋白、朊蛋白或PEG浓缩时混入的PEG。在层析过程中第25分钟时出现重大失误，发现凝胶柱干裂，停止洗脱，虽然记录到峰值，但由于存在2ml延迟，未收集到峰值处洗脱液，只收集到第19和20min的洗脱样品（24和25号管收集

19、液,），该处样品处于多个蛋白洗脱峰之间，由此推断成分复杂，目的蛋白不纯。 图2蛋白样品凝胶层析洗脱图谱2.2蛋白质纯度图3和图4分别为凝胶层析纯化之前和之后的SDS-PAGE电泳图谱。图3中由于留样A（树脂吸附后蛋白上清液）浓度太大并可能部分发生凝固，且未稀释，影响了蛋白Maker及其他样品泳道的效果。但仍然可以分辨出蛋白Maker的六条带，最下面一条为溶菌酶的条带，分子量为143kD。对应的4号和6号泳道蛋白样品中分离得到的溶菌酶的条带颜色较深，证明粗提取得到了浓度较高的溶菌酶，但含有大量杂蛋白，主要为卵清蛋白（45kD）、卵白蛋白（66.4 kD）及其他杂蛋白，还含有少量的PEG（20.1

20、kD处）。留样A显然含有大量杂志蛋白，分子量主要分布在44.3到97.2 kD之间。从图4可以看出，6号和7号泳道的第19和20min的洗脱样品即24和25号管收集液，因为处于杂蛋白峰值和溶菌酶峰值之间，成分复杂，显然是不纯的，主要有两条带，除溶菌酶外还有少量卵清蛋白。8号泳道为借用其他组较好的层析后样品，可以看出纯化效果较好，五杂蛋白。9号泳道的留样A稀释100倍后电泳效果较好，主要成分为杂蛋白。两图中杂蛋白样品的条带中也有少量溶菌酶，证明溶菌酶在每一步都会不可避免的损失。随着纯度越高，得率越低。条带颜色的深浅一方面与酶浓度有关，另一方面与染料的选择及浓度和染色时间有关，一般染料浓度越高，染

21、色时间越长，染色越深，但脱色也更难。在本试验中，加样量在5 L 左右、固定染色20min 比较合适，脱色时在摇床上洗脱过夜效果最好。图3溶菌酶产品的SDS-PAGE电泳图谱1.标准蛋白Marker2.留样A （未稀释）树脂吸附后蛋白上清液3.留样B10（NH4）2SO4溶液洗脱树脂的洗脱液4.留样C透析液去杂蛋白离心后的样品5.留样D透析液调节PH至4.6后产生的白色杂蛋白6.留样EPEG浓缩后的样品图4层析后溶菌酶产品的SDS-PAGE电泳图谱1.标准蛋白Marker2.留样B10（NH4）2SO4溶液树脂的洗脱液3.留样C透析液去杂蛋白离心后的样品4.留样D透析液调节PH至4.6后产生的白

22、色杂蛋白5.留样EPEG浓缩后的样品6.层析24号管收集样品7.层析25号管收集样品8.其他实验小组层析较好的收集样品9.留样A（稀释100倍）树脂吸附后蛋白上清液2.3蛋白质浓度图5所示为蛋白质标准曲线，相关系数R达0.985，表明线性关系较高，符合实验要求。利用此标准曲线可计算样品的溶菌酶浓度、得率等。图5蛋白质标准曲线提取的蛋白样品稀释10倍后的OD595=0.2905，代入回归方程得到该蛋白样品浓度为3.16mg/ml。由此计算蛋清中溶菌酶的得率为： 3.16mg/ml 1.5ml得率=_=0.0474mg/100ml100ml但据参考文献，蛋清溶菌酶提取率可达0.4g/100ml。5

23、但采用本实验的提取方法, 实验的酶得率非常低。可能原因是离子交换剂选择的不同，提取个步骤中损失较多。张文会等使用将D125阳离子交换树脂的Na+型、H+型混合，本实验使用724型酸性阳离子交换树脂，吸附能力可能存在一定差异。在粗提取中用1mol/L的HCl调节PH时局部过酸使部分溶菌酶变性凝固；在蛋清的树脂吸附使用磁力搅拌而不是手动搅拌，影响了吸附效果，电泳结果显示有微量的溶菌酶残留在蛋清上清液中；在去除杂蛋白的过程中流失了少量树脂也损失了溶菌酶；其他个步骤中都有少量含溶菌酶的溶液残留在容器壁上，造成溶菌酶损失。3 讨论3.1 树脂吸附实验后得知在阳离子交换层析吸附过程中,不能用磁力搅拌器搅拌

24、, 需要手动搅拌,且不能搅动太快，不能出现泡沫。因为磁力搅拌器是靠摩擦力搅拌, 易将树脂打碎, 影响溶菌酶的吸附效果。本实验吸附过程使用了磁力搅拌器搅拌，对实验造成了影响，直接影响了溶菌酶的得率。3.2 调节PH及盐析在用调节蛋清PH时使用了1mol/l的HCl，可能酸度过高滴加速度过快，导致了部分蛋白局部过酸变性，影响的得率。吸取这次教训，在用硫酸铵固体盐析溶菌酶之前，要把硫酸铵固体结晶研磨成细微的粉末状，加入时要缓慢加入，不断搅拌防止局部盐度过高导致蛋白局部变性。由此可见，在提取蛋白过程中加入任何溶液或固体都要极缓慢的加入，并且搅拌，防止局部浓度过高对蛋白活性产生影响。3.3透析与浓缩因为

25、洗脱溶解蛋白样品时没能控制好蒸馏水用量，且透析过程使样品溶液体积进一步增加，因此用PEG-20000浓缩蛋白样品。可能是由于透析袋没有扎紧或透析袋本身的问题，PEG-20000进入到透析袋，与蛋白样品混在一起，这样必然影响目的蛋白的纯度并可能影响溶菌酶的活性。3.4溶菌酶凝胶层析 本实验凝胶层析中凝胶柱是自己手动填充的，这一步非常重要，装柱的质量直接关系到分离样品的成败。柱子应固定在稳定的支架上,并保证其垂直，同时需寻找合适体积的洗脱液与凝胶灌入柱中，注意不能出现断层现象，再经常压平衡过夜，加压平衡2小时，用蓝色葡聚糖-2000检验，蓝色色带狭窄均匀，才算顺利制备出凝胶柱。本实验凝胶柱制备非常

26、成功，凝胶柱性能良好。层析过程所用的洗脱液一定要超声脱气1小时以上，脱气后不要震荡，不要倾倒混合，一面在此混入气体，已脱气的要用保鲜膜封口，以免混入杂质。层析系统的入口管要保证完全没入洗脱液。实验最大的遗憾是在样品层析时发生凝胶柱干裂，虽然已记录到峰值，但由于体积延迟未收集到峰值处电泳纯的样品。分析原因可能是系统接口处漏气，凝胶柱产生负压而进入空气。当时两名同学忙于记录数据及收集样品，未及时发现问题。这是一次深刻的教训，任何实验中如果出现一点差错，就可能前功尽弃，3.5 SDS-PAGE电泳电泳是本实验的眼睛，用来检测每一步骤中样品是否存在，纯度如何，以及去除的杂蛋白成分如何，多条电泳条带进行

27、多重、两两比较、横向及纵向比较，帮助分析提取效果，凝胶层析纯化及蛋白质得率。出现问题可以从电泳图谱上寻找问题的根源。电泳过程中还要注意的是点样的蛋白样品的浓度。如果浓度较大的样品需要适当稀释，如本实验留样A浓度较大，第一次电泳是未稀释，导致泳道拥挤，影响了整个胶版上其他的泳道。第二次电泳把留样A稀释了100倍，得到较好的电泳图谱。还要注意如果蛋白样品已大量发生凝固，不能通过电泳分析纯度，因为凝固的蛋白无法在胶版内运动。3.6实验心得从以上分析看出本次实验前面大部分都很顺利，只是最后层析结果令人遗憾。总体上还算成功，在实验组人员较少，每天平均2-3个人的情况下作出这样的成果实属不易。当然这也部分归功于前期准备较充分，人员安排恰当，节省了等待时间。从实验准备、实验操作到实验总结我都全程参与，既要从宏观上把我整个实验，又要从细节上弄清每一步的实质，这对我来说是一个很好的锻炼。参加实验的同学从中学到了很多东西，实验技巧得到提升，也明白了任何实验不会一帆风顺，需要实验者不断地探索。同学之间关系更加融洽，团结，协调，充满着科研的氛围。身为本实验小组组长我倍感欣慰。参考