4、机制研究的套路总结8-DNA羟甲基化

1、分子机构研究课程(8)DNA甲基化课题： c因子激活a蛋白调节b基因启动子DNA甲基化对d疾病的影响1 .概念介绍：表观遗传学是生命科学目前关注的前沿，是一种基因调节机制，与古典遗传学不同，表观遗传学不参与基因序列的变化，是可逆的，在基因调控中发挥着重要的作用。 DNA甲基化是表观遗传学的主要调控机制之一，在维持正常细胞功能、遗传标记、胚胎发育、染色质结构变化和人类疾病的发生发展中发挥着重要作用。所谓DNA甲基化，是指s -腺苷蛋氨酸(S-adenosyl methionine，SAM )提供甲基，在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT )的催化剂下，在胞嘧啶

2、的C5位上附加甲基，形成5 DNA甲基转移酶(DNMTs等)和DNA脱甲基化酶(TET蛋白等)控制了基因组DNA序列甲基化的动态变化，一般来说，基因启动子区CpG岛的甲基化有不能与DNA结合的转录因子，因此可以抑制基因转录，该区域的脱甲基DNA甲基化主要发生在CpG异核苷酸上(如图1 )，CpG在人基因组中出现的概率较低，主要集中出现在CpG岛(CpG island )上。 CpG岛是一个由200bp碱基组成的DNA序列，其中GC含量占60%以上，该区域主要位于某基因的启动子区域。 CpG岛DNA甲基化是表观遗传学研究的关键，它改变染色体结构，影响邻近基因的表达。 高度甲基化的DNA可以与组蛋

3、白紧密结合，募集转录抑制因子，抑制转录活性因子和启动子区域结合，达到抑制基因表达目的的DNA低甲基化放松染色体结构，促进转录活性因子、RNA聚合酶和目标序列的结合，促进相关基因的高表达。图1:CPG异核苷酸上DNA的甲基化图像表观遗传学最初被用于肿瘤的研究。 由于在许多肿瘤细胞中发现CpG岛高度甲基化，抑制癌基因的表达，诱发肿瘤的发生，DNMT抑制剂5-AZA等用于肿瘤的临床治疗。2 .形象：DNA甲基化循环的过程如图2 :通过Sam提供甲基化，在DNMT的催化下完成甲基化过程，同时产生副产物S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosyl homocysteine，SAH )，SAH还产生同型半胱

4、氨酸同型半胱氨酸是这个循环中的重要成分，研究了上升的同型半胱氨酸损伤DNA的修复机制，诱发氧化应激，引起细胞死和中枢神经系统功能的障碍。 循环图表明，同型半胱氨酸有两个进路，能够形成蛋氨酸再次参与甲基化循环，而能够分解代谢半胱氨酸。 同型半胱氨酸转化为蛋氨酸的过程是在蛋氨酸合成酶的作用下完成的，而需要维生素B12和5-甲基四氢叶酸的辅助，而5-甲基四氢叶酸需要从食物中的叶酸转化的同型半胱氨酸也需要维生素B6的参与。 由于发现维生素B6、维生素B12和叶酸的缺乏与同型半胱氨酸水平的上升密切相关，因此，可以通过食物疗法保证维生素B12、维生素B6和叶酸的供给，达到预防疾病的目的。图2:DNA甲基化

5、循环的过程3 .研究构想：3.1 D疾病中b基因启动子序列甲基化状态与b蛋白表达的相关性分析43.1.1D疾病组和正常对照组细胞基因组DNA整体甲基化水平43.1.2D疾病和正常对照组细胞b基因启动子控制序列DNA甲基化水平. 43.1.3D疾病与正常对照组细胞b蛋白表达水平与b基因启动子控制序列DNA甲基化水平的相关分析43.2建立贴片甲基化技术特别报告载体，测定DNA甲基化对b基因启动子转录活性的调控53.2.1成功构建了基因启动子控制序列PGL-3promoter荧光体报告载体53.2.2质粒PCR大量扩增b基因启动子控制序列片段53.2.3体外人工甲基化和甲基化敏感性限制酶酶切检定53

6、.2.4检测CpG甲基化和非甲基化目的段的荧光素，报告载体的荧光素活性53.3A蛋白调控b基因启动子DNA甲基化和转录活性的分子机制63.3.1A蛋白招集脱甲基化酶TET2与b基因启动子序列6结合3.3.2A蛋白促进细胞b基因启动子甲基化63.3.3C因子促进细胞b蛋白表达63.1 D疾病中b基因启动子序列甲基化状态与b蛋白表达的相关性分析3.1.1D疾病组和正常对照组细胞基因组DNA整体甲基化水平用磁珠筛选法分离10例d疾病患者和正常对照细胞，提取基因组DNA，用MethylampTM全体DNA甲基化检测试剂盒检测d疾病和正常对照细胞基因组DNA全体甲基化水平。 结果d疾病组细胞基因组DNA

7、整体甲基化明显低于正常对照组。注释：1)疾病组和对照组的样品，如果能得到临床样品是最好的，否则，可以利用相同组织类型的疾病细胞系和正常细胞系。2 )如果是临床样品，细胞的分离方法不一定是磁珠筛选法，有必要用流式细胞仪筛选等，根据病的种类进行调整。3 )疾病群的DNA整体甲基化水平是下降还是上升，取决于b基因对疾病的贡献，但如果抑制疾病促进时甲基化水平经常降低的疾病，甲基化水平就会变高。3.1.2D疾病和正常对照组细胞b基因启动子控制序列DNA甲基化水平首先确定b基因启动子中的CpG岛，然后在CpG岛内确定CpG位点，检测所有CpG位点的DNA甲基化水平。 亚硫酸盐处理基因组DNA，嵌套PCR扩

8、增DNA产物，t向量克隆序列控制了序列CpG岛的甲基化水平。 结果d疾病组细胞b基因启动区所有CpG部位的DNA甲基化水平明显低于正常对照组。3.1.3D疾病与正常对照组细胞b蛋白表达水平与b基因启动子控制序列DNA甲基化水平的相关分析用实时定量PCR检测d疾病和正常对照组单核细胞b蛋白mRNA表达水平，结果显示d疾病组细胞b蛋白mRNA水平比正常对照组明显上升。用Western blot法检测d疾病和正常对照组细胞b蛋白表达水平，结果显示d疾病组细胞b蛋白水平比正常对照组明显上升。d疾病与正常对照组细胞的b基因启动子DNA甲基化水平和b蛋白表达呈负相关。建立3.2补丁甲基化技术特别报告载体，

9、检测DNA甲基化对b基因启动子转录活性的调控3.2.1成功构建了基因启动子控制序列PGL-3promoter荧光体报告载体用T4连接酶连接b基因启动子控制序列片段(体外甲基化技术将目的片段CpG甲基化，未甲基化阴性对照)和酶切处理线状报告载体，用DH5大肠菌转化纯化载体质粒。 双酶切检测、质粒基因组序列分析和Pubmed BLAST序列比较检测获得了b基因启动子控制序列PGL-3promoter突触报告载体。注释：双酶切断时具体选择哪种酶取决于质粒载体上的多克隆部位，且是插入序列中不可含有酶的酶切断序列。3.2.2质粒PCR大量扩增b基因启动子控制序列片段为了得到大量纯化的b基因启动子控制序列

10、片段，以报告载体为模板，用质粒PCR技术对目的片段进行大量扩增，用凝胶回收技术纯化回收目的片段。3.2.3体外人工甲基化和甲基化敏感性限制酶酶切检定通过甲基化敏感性限制酶ACI酶切断来鉴定体外甲基化程度，ACI酶切断部位为5cccg3或3ggcG5， 酶切部位受CpG甲基化保护时不被酶切的体外人工甲基化即使将CpG甲基化组的目的片段完全甲基化也不被酶切成完全的片段，伪甲基化组的目的片段不被甲基化，被ACI酶切成两个片段，体外人工甲基化3.2.4检测CpG甲基化和非甲基化目的段的荧光素，报告载体的荧光素活性将CpG甲基化和非甲基化目的段的荧光素报告载体和pRL家族人肾素(Rluc )对照报告基因

11、载体在细胞株培养中转染48小时，用双荧光素酶报告载体测定荧光素酶活性，CpG梅结果： b基因启动子的调控序列是甲基化敏感部位，b基因启动子受DNA甲基化控制。3.3A蛋白调控b基因启动子DNA甲基化和转录活性的分子机制3.3.1A蛋白招集脱甲基化酶TET2与b基因启动子序列结合分离3例健康志愿者细胞，用c因子激活a蛋白，用免疫共沉淀法(IP )证实a蛋白招募甲基化酶TET2蛋白的染色质免疫共沉(CHIP)-qPCR，证实a蛋白与单核细胞b基因启动子CpG序列结合3.3.2A蛋白质促进细胞b基因启动子甲基化为了证实a蛋白募集的TET2蛋白是否引起b基因启动子甲基化，用亚硫酸盐测序法测定了c因子处理组和对照组单核细胞b基因启动子CpG岛的CpG部位DNA甲基化水平。 结果显示，c因子处理组的b基因启动子DNA甲基化水平明显低于对照组，a蛋白招募TET2蛋白，提示单核细胞的b基因启动子不甲基化。3.3.3C因子促进细胞b蛋白的表达3.2部