Western Blot基本原理、过程及注意事项

1、Western Blot基本原理、流程和注意事项原理就是将蛋白质转移到膜上，然后使用抗体进行测试。对于已知的表达蛋白，使用相应的抗体检测，新基因的表达产物可以通过融合部分的抗体检测。有三个主要过程：蛋白质电泳、薄膜、测试。样品的准备样品种类主要包括培养的细胞、组织(需要更换的)、特殊细胞(切除的肿瘤细胞)等。1、热解物主要有RIPA和3种去污，RIPA适合细胞质内蛋白质的检测，3种去污适合总蛋白质。三种去污分为离子类型和非离子。离子型的分解能力像SDS等强而非离子型的有NP-40、Tritonx-100等。2、热解物的成分，作用试剂提高离子强度NaclPHtris-盐酸缓冲液分解剂SDS溶剂水

2、蛋白酶抑制剂PMSF、Cocktail等磷酸酶抑制剂Cocktail等3、样例缓冲区sample buffer作用试剂增加负电SDSPHtris缓冲液抗氧化DTT密度甘油指示剂溴酚蓝注意事项：1.样品要保持低温，实验过程要低温运转，抑制酶活性。分解后，样品溶液粘滞是由长结构DNA引起的，因此必须用均匀的同质性切断DNA。超声波通常不使用。因为蛋白质会引起不可逆转的变性。将2，2X样品缓冲液和样品1: 1混合。保留4度。3、在混合样品混合液和样品之前，要在100 或沸水中加热3-5分钟左右，迅速插入冰块，使蛋白质完全变质。粘合剂安装：胶粘剂的主要成分是丙烯酰胺和N，N-亚甲基双丙烯酰胺，29%(

3、w/v)丙烯酰胺和1%(w/v)N，N-亚甲基双丙烯酰胺存储液丙烯酰胺29g，N，N，N)储存在棕色瓶子里，保存4的光。4、分离胶公式：例如，20毫升的8:H2O9.3 ml30acylamide5.3 ml1.5米树(ph 8.8)5.0 ml10X SDS0.2 ml10X对硫酸胺(AP)0.2 mlTEMED0.012ml5、浓胶配方：6ml是H2O4.1 ml30acylamide1.0 ml1m树(ph 6.8)0.75 ml10X SDS0.06 ml10X对硫酸胺(AP)0.06 mlTEMED0.006 ml注意事项：1、橡胶是为了防止产生气泡。空气影响胶粘剂的聚合，在蛋白质的

4、表观分子量分析中影响很大。2，因为有SDS，所以每次搅拌的时候不要太大，以免产生太多的气泡。3，蛋白质容易与SDS脱落，失去负电荷，因此SDS被添加到粘合剂中，以赋予蛋白质持续的负电荷。4、清洁垫，避免橡胶板和压缩、泄漏。5、制作粘合剂时，水不能慢慢破坏粘合剂，其作用：平衡胶棉，能赶上气泡。固定胶水后，用滤纸吸干，有水的时候带子会歪。6，先插上梳子，填满浓缩胶水。溴酚蓝迅速跳出胶水时停止。转动胶卷根据杂交方案、皮转移蛋白的特性、分子大小等因素，选择合适的材料、孔径、规格的杂交膜。韦斯特氏薄膜主要有两种：硝化纤维素膜(NC)和PVDF膜。NC膜是蛋白质印迹实验的标准固相支撑物，在低离子转移缓冲液

5、环境中，大部分带负电荷的蛋白质与膜起疏水作用，结合了高亲和力，但在非离子型洗涤剂作用中，结合的蛋白质也可以被溶解。根据转移蛋白质的分子量大小，选择具有不同孔径的NC膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白质的结合更加牢固。通常使用2种规格(0.45m和0.2m)的NC膜。大于20kD的蛋白质可以使用0.45m的膜，小于20kD的蛋白质必须使用0.2m的膜。使用0.45m的胶片会产生“Blowthrough”现象。PVDF胶片敏感度、分辨率和蛋白质亲和力高于传统胶片，适用于低分子质量蛋白质检测。但是，PVDF胶片使用前必须用纯甲醇浸泡。组装转移按三明治原则进行：海绵滤纸粘合剂膜滤纸海绵。胶

6、卷必须先泡在纯甲醇里。放各层，抓紧夹板。记住：在冰浴中放入输送槽，放入“三明治”(黑色面对黑色面)，然后放入输送缓冲液，插入电极，250mA，2h。注意：必须重新检查三明治和电极是否正确组装，电源是否打开。盘旋膜结束后切断电源，取出蛋白质膜。注意事项：1、整个过程不能保持膜的湿润。干了就会产生气泡。转动薄膜，蛋白质在气泡中横向运行。2、为了避免泡沫的产生，在甲醇中放胶卷时倾斜和缓慢。3、交换膜缓冲液一般不附SDS，但在大槽中，由于导电差异，添加少量，添加甲醇，保持膜和水的介绍线。4、甲醇容易挥发，添加15 20时要用盖子搅拌。5、三明治插入插槽时，油箱里必须有液体。6、电流不能太高，高电流容易产生热量，过热会导致带状扩散。封闭的1.25 ml TBS洗衣膜5min，在室温下摇晃。2.在室温下将薄膜在25毫升密封缓冲液中摇晃1h。注意事项：1、密封缓冲液可以用作0.5%牛血清白蛋白，但价格昂贵。常用5%脱脂奶粉。2、封闭作用是结合膜上其他活性部位，防止抗体结合。3、一般室温可以在1-2h左右摇晃，以4度过夜，37度也可以在0.5h(一般背景可能很高)左右度过。免疫杂交和发色1.15ml TBS/t三次(5分钟/t)。2.在适当的稀释度中加入抗菌，在室温下孵化1-2小时或4C后，慢慢摇晃。3.15ml TBS/t三次(5分钟/t)。4.适当稀释度的碱性磷酸酶(AP)或辣根添加过氧化