1-细胞培养 文本资料细胞培养

1、细胞培养技术 cell culture,上海交通大学医学院 瑞金临床医学院 洪秀华教授,细胞培养技术,从生物体内取出组织或细胞，在体外(in vitro)模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，对这些组织或细胞进行孵育培养，使之保持一定的结构和功能，以便于我们观察研究，这种方法就是细胞培养（cell culture）。有时细胞培养也称为组织培养（tissue culture），二者可作为同义语使用。,细胞培养的工作始于20世纪初目前广泛应用于生物学、医学的各个领域，并且是各种细胞工程技术的基础。哈里森（ Harrison，1907），因此被称为“组织培养之父”,一、基础理论,（一）

2、培养细胞的类型及其特点 体外培养细胞大多培养在瓶皿等容器中，根据它们是否能贴附在支持物上生长的特性，可分为贴附型和悬浮型两大类。,（1）贴附型,大多数培养细胞均为贴附型，它们必须贴附在支持物表面生长，这类细胞在体内时各自具有其特殊的形态，但在体外培养时贴附于支持物后形态上表现单一化而失去体内原有的某些特征，多呈上皮样或成纤维细胞样。,培养细胞的类型及其特点,贴附细胞型MRC-5成纤维细胞,培养细胞的类型及其特点,贴附型细胞正常猴肾单层上皮细胞,正常贴附型细胞的特点,接触抑制：正常贴附型细胞具有接触抑制的特性，细胞相互接触后可抑制细胞的运动，因此细胞不会相互重叠于其上面生长。 密度抑制：细胞生长

3、、汇合成片后，虽发生接触抑制，但只要营养充分，仍可增殖分裂，但当细胞数量达到一定密度后，由于营养的枯竭和代谢物的影响，细胞分裂停止，称为密度抑制。,肿瘤细胞的接触抑制及密度抑制往往减弱或消失，因此细胞可向三维空间发展，导致细胞堆积，并可生长至较高的终末细胞密度。,(2) 悬浮型,少数细胞在培养时不贴附于支持物上，而以悬浮状态生长，包括一些取自血、脾或骨髓的培养细胞，尤其是血液白细胞，以及一些肿瘤细胞。 细胞悬浮生长时可以呈单个细胞或细小的细胞团，胞体为圆形。 其优点是在培养液中生长，生存空间大，允许长时间生长，便于大量繁殖。,（二）培养细胞的增殖过程,培养细胞的生命期 培养细胞的生命期（lif

4、e span）指的是细胞在培养中持续增殖和生长的时间，一般可分为原代培养期、传代期和衰退期。从体内取出细胞接种培养到第一次传代叫原代培养，一般持续1-4周。,原代细胞一经传代后便称为细胞系（cell line），进入传代期，此期在全生命期中持续时间最长，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体的核型。一般情况下可传代10-50次，随后细胞增殖缓慢以至完全停止，细胞进入衰退期，最后死亡。,肿瘤细胞系可无限增殖而无衰退期，正常细胞系也可在传代期末期或衰退期发生自发转化，细胞获得永生性即永久增殖的能力，称为无限细胞系或连续细胞系。,3、培养细胞一代的增殖过程,培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间相

5、对孤立，营养是有限的。当细胞增殖至一定密度后，则需分离出一部分细胞接种到其他容器，并及时更新培养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（passage 或subculture）。,从细胞接种到下一次传代再培养的一段时间叫一代。需要注意的是细胞培养一代与细胞倍增（doubling）的概念是不同的，细胞倍增指的是细胞数增加一倍。一般地，细胞培养一代的过程中，细胞可倍增2-6次。,细胞传一代以后，细胞群体一般要经过潜伏期、指数增长期与平台期三个阶段。 以贴附型细胞为例说明如下：细胞接种后呈悬浮状态，在05-4 h内贴附于支持物，进入潜伏期，此期细胞无增殖发生，原代细胞持续约24-96 h，而肿

6、瘤细胞或无限传代细胞仅需6-24 h。,随着分裂相细胞的出现并逐渐增多，细胞群体进入指数增长期，此期又称对数期，细胞增殖旺盛，成倍增长，活力最佳，适于进行实验研究；此期时间长短因细胞本身特性及接种密度、血清浓度而不完全相同，一般可持续3-5天。,随着细胞数量的逐渐增多，细胞相互接触汇合成片，因接触抑制及密度抑制细胞停止分裂繁殖，进入平台期，细胞数目不再增加，但仍维持一定时间的活力，此时应及时分离传代，否则细胞将因中毒而发生改变甚至死亡。悬浮型细胞一般没有潜伏期，接种并添加新鲜培养液后即可迅速进入指数增长期。,3. 培养细胞的生存条件,培养细胞需要特定的培养基和培养设备。培养细胞在培养器皿中生长

7、，浸浴于培养液，并需要特有的环境，包括一定的温度、湿度和气体成分。,培养细胞的生存条件,营养物质糖、氨基酸、维生素、无机离子、微量元素等,（1）培养基,培养细胞所需营养物质与体内细胞相同，包括糖、氨基酸、维生素、无机离子、微量元素等。细胞在体外生存于含各种营养成分的培养基中。 来自于动物体液和分离组织提取的天然培养基有血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等，但制作过程复杂，批间差异大，已逐渐被合成培养基取代。,培养基的种类,按其物质状态，分半固体培养基（如软琼脂培养基）和液体培养基两类，其中液体培养基（即培养液）使用最为广泛。目前市场上有多种配制好的细胞培养液出售，但价格较昂贵。实际工作中多用市售培

8、养基干粉来配制培养液。,配制培养液时，尚需加一定量的动物血清（胎牛或小牛血清）。配制时根据添加血清量的多少，构成作用不同的培养液，用于不同细胞和不同研究目的。一般情况下需添加10 20的血清，以维持细胞较快的生长增殖速度，称为生长培养液；为维持细胞缓慢生长或不死，加2 5血清含量即可，称为维持培养液。 此外为防止污染，培养液中尚需加一定量的抗生素（多用青霉素100单位/ml和链霉素100g/ml）。,常见的培养基：,1、MEM(minimum essential media) 含有12种必需氨基酸、谷氨酰胺，8种维生素及必要的无机盐，成分简单，易于添加某种特殊成分适应某些特殊细胞的培养。,2、

9、DMEM（ Dulbeccos modified Eagle medium) 是由Dulbecco等人在MEM培养基的基础上研制而成。相比MEM增加了各成分的用量。分高糖型和低糖型，各自葡萄糖含量为4500g/L、1000g/L。高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适合于生长较快、附着较困难的肿瘤细胞。,3、IMDM（Iscoves modified Dulbeccos medium） 含有42种成分，较DMEM增加了许多非必须氨基酸及一些维生素，增加了HEPES，葡萄糖含量为高糖型。适合于细胞密度较低、细胞生长较困难的情况，如白细胞融合之后杂交细胞的筛选培养，DNA转染后转化细胞的筛选培养。

10、,4、RPMI1640 其成分较为简单，适合于许多种类细胞的生长，如肿瘤细胞或正常细胞、原代培养或传代培养的细胞。RPMI1640是目前应用最为广泛的培养基之一。,5、HamF10、HamG12 特点是在配方中加入了一些微量元素和无机离子，可以在加入很少血清的情况下使用，特别适合于进行单细胞分离培养。 HamG12培养基也是无血清培养基中常用的基础培养基,7、McCoys 5A McCoys 5A培养基是McCoy T.A等人在1959年研制成功的，是一种专门为肉瘤细胞设计的培养基，后来发现它特别适合于原代细胞培养，适合于较难培养的细胞的生长。,如何选择培养基,没有固定标准，以下为参考： 1、

11、建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。着可以参考文献，或在购买细胞株时咨询。 2、本实验室惯用的培养基不妨试一试，许多培养基可以适合于多种细胞。,3、根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如小鼠细胞株多选择RPMI1640；进行细胞杂交、基因转移实验，可选择IMDM。 4、用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。,无血清培养基,无血清培养基即不需要添加血清就可维持细胞在体外生长较长时间生长繁殖的合成培养基。 用于观察一种生长因子对某种细胞的作用（这时需要排除其他生长因子的干扰

12、，而血清中可能含有各种生长因子）；或需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质的能力；或大规模的培养某种细胞，以获得它们的分泌产物的时候。,无血清培养基的基本配方,无血清培养基分为基础培养液和添加组分两大部分。基础培养液以HamF12和DMEM最为常用，一般两者以1:1混合。 添加组分包括： 1、促贴壁物质： 一般是细胞外基质，如纤连蛋白（FN）、层粘连蛋白（LN）等。它们还是重要的分裂素以及维持正常细胞功能的分化因子，对许多细胞的繁殖和分化，起着重要的作用。,2、促生长因子及激素 如表皮生长因子（EGF）、神经生长因子（NGF）、内皮细胞生长因子（ECGF）等。 3、酶抑制剂 终止胰酶的消化作

13、用，达到保护细胞的目的。最常用的是大豆胰酶抑制剂。 4、转铁蛋白和牛血清白蛋白 5、微量元素 硒最为常见。,pH调整液,1、NaHCO3溶液 2、HEPES液 是一种弱酸羟乙基哌嗪乙硫磺酸。HEPES对细胞无毒性，可防止pH值迅速变动,抗生素液,常用的是青链霉素，俗称“双抗溶液” 青霉素使用的终浓度为0.1g/L。一般配成100倍浓缩液，可用PBS或培养基配制。,谷氨酰胺补充液,谷氨酰胺在细胞代谢过程中起重要作用，合成培养基中都要添加，由于谷氨酰胺容易降解，所以都是使用前添加。谷氨酰胺使用终浓度为0.002mol/L。一般配制为100倍浓缩液。,（2） 细胞培养设备,1、培养器皿 2、培养环境

14、：CO2恒温孵育箱 CO2恒温孵育箱是目前普遍应用的细胞培养设备， 箱内应置水槽以维持箱内温度、湿度和避免培养液蒸发， 蒸馏水需无菌水并应加无腐蚀性和无挥发性的防腐剂以防生霉。应定期对箱内进行消毒。 另外，细胞培养过程中进行换液、传代等工作时需在无菌工作台上进行。,二氧化碳培养箱,二氧化碳培养箱（培养箱）提供箱内一定浓度二氧化碳气体和相对湿度，创造了细胞与微生物正常生命活动的环境条件，使之在脱离复杂机体内环境的直接影响，在体外能生长瀪殖。,培养箱的结构 以水套式CO2培养箱为例，培养箱基本有三壁结构箱体、控制中心（包括键盘、显示器、指示器等）、CO2/O2传感器、增湿盘等。,二氧化碳培养箱 控

15、制中心（包括键盘、显示器、指示器等）,培养箱的分类、结构特点和使用 水套式CO2培养箱,可分为单双内舱水套培养箱两种。 箱内传感器有热传导(T/C）和红外（IR）传感器两种。 水套注入口(用于注满水)。 水套排水口（在水套注满过程中或热胀冷缩时让空气逸出，不能覆盖）。 水套排气口（用于迅速排空水套）。 加热式内门（为了保持箱内干燥）。 箱内气体取样口（可使用Fyrite或类似工具提取箱内样本的含量）。,二氧化碳培养箱的结构,二、技术方法,1细胞分离和原代培养 原代培养也叫初代培养，指从供体取得组织，分离得到所需细胞后接种于培养瓶，进行首次培养。,技术方法,细胞分离,原代（初代）培养,消化法传代

16、,组织块剪切,消化法使组织进一步分散,制备获得细胞悬液计数后，加入营养液稀释成一定浓度细胞悬液孵箱中进行培养,细胞悬液计数后，加入营养液稀释成一定浓度细胞悬液孵箱中进行培养,将原代细胞培养物用胰酶和EDTA消化处理后，收集洗涤，再分装至 含有新鲜营养液的培养瓶中继续培养,（1） 细胞悬液的分离方法,培养材料为血液、羊水、胸水和腹水等细胞悬液时，可采用离心法分离。一般用5001000rpm的低转速，时间约510min。如果一次离心样品量很多，时间可适当延长，但离心速度过大、时间过长，会挤压细胞造成损伤甚至死亡。,(2)组织块的分离方法,培养材料为组织块时，首先要把组织块剪切至尽量小，然后用消化法

17、使组织进一步分散，以获得细胞悬液。对细胞间质较少的软组织，如胚胎、上皮、肝、肾等可用胰蛋白酶消化；对于纤维性组织和较硬的上皮组织、癌组织等可使用胶原酶消化。,消化液,胰酶（Trypsin）：0.1%0.25%，用D-HanKS液配制，最佳pH89 EDTA ：0.02%，作用于细胞间连接尤其对贴壁的细胞适用 胶原酶（Collagenase）：0.10.3mg/L(20万u/L)， pH6.5，Ca2+，Mg2+不抑制其活性，作用于胶原组织，适用于上皮类原代细胞。,2培养细胞的传代,细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程称之为传代；进行一次分离培养称之为传一代。 培养细胞传代根据不同细胞

18、采取不同的方法。,（1）贴壁细胞的消化传代,贴壁生长的细胞多用消化法传代，传代中常用到二乙烯四乙酸二钠（EDTA）。EDTA能从组织生存环境中吸取Ca2+、Mg2+，这些离子是维持组织完整的重要因素。但EDTA单独使用不能使细胞完全分散，因而常与胰蛋白酶按不同比例混合使用，效果较好。,消化传代的基本过程是：,吸除或倒掉瓶内旧培养液，向瓶内加入少量约12ml消化液（一般含胰蛋白酶、EDTA），轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面； 然后在37环境下孵育1-3min，把培养瓶放置显微镜下进行观察，发现胞质回缩、细胞间隙增大后，应立即倒掉消化液，加入Hanks液冲洗一次以终止消化； 然后加入少许

19、培养液，用弯头吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，使之脱落形成细胞悬液，以1：2或1：3的比例接种在新的培养瓶内。,（2）悬浮细胞的传代,悬浮生长的细胞可直接添加新鲜培养液，或离心收集，接种到新培养瓶。 通常在45天需传代，一般以1:4稀释传代。,3细胞的冻存和复苏,培养细胞在传代中性质易发生改变, 有支原体污染的危险。研究工作也要求细胞株的代数应维持在一定期限内。解决这些困难的方法就是将细胞冻存，需要的时候再行复苏。细胞冻存在液氮中，从理论上讲贮存时间是无限的。,在不加保护条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水会形成结晶，能导致细胞内发生一系列变化而引起细胞死亡。 如向培养基中加入保护

20、剂甘油或二甲基亚砜（DMSO），可使冰点降低，在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外。,溶解细胞时，速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的50后，细胞仍能生长，活力不受任何损害。 细胞冻存与复苏的原则是“慢冻快融”。冻存时选用对数生长期细胞，用常规方法收集细胞。在液氮中可长期保存。,冻存细胞复苏时，将冻存于液氮中的冻存管取出，迅速放入3740水浴中使其在1min内融化。在无菌条件下打开冻存管，取出细胞悬液至离心管中，补加10ml培养液，5001000rpm低速离心5min，去上清，加入新鲜培养液适量，转入培养瓶中置37培养。,4 细胞培养微生物污染的检测,细胞培养过程中操作不当时，

21、易引发微生物污染。微生物污染一旦明确，多数将无法救治。为了防止污染的蔓延，还应及时丢弃污染细胞。 （1）霉菌和细菌污染 霉菌和细菌繁殖迅速，能在很短的时间内压制细胞生长或排出有毒物质杀灭细胞，因此霉菌和细菌污染较易发现。,霉菌污染后多在培养液中形成白色或浅黄色飘浮物，一般肉眼可见，较易被发现，短期内培养液多不混浊，倒置显微镜下可见于细胞之间有纵横交错穿行的丝状、管状及树枝状菌丝，并悬浮飘荡在培养液中；很多菌丝在高倍镜下可见到有链状排列的菌珠；念珠菌或酵母菌形态呈卵形，散在细胞周边和细胞之间生长。,细菌污染后培养液短期内颜色变黄，表明有大量酸性物质产生，出现明显混浊现象；有时静置的培养瓶液体初看

22、不混，但稍加震荡，就有很多混浊物漂起；倒置显微镜下观察，可见培养液中有大量细小的圆球状颗粒飘浮，有时在细胞表面和周围有大量细菌存在，细胞生长停止并有中毒表现。,（2）支原体污染,支原体污染是一个常见而又棘手的问题。支原体是一种大小介于细菌和病毒之间（最小直径0.2m）并独立生活的微生物，因此可通过滤菌器，支原体对热敏感但对一般抗生素不敏感。支原体污染细胞后，培养液可不发生混浊，多数情况下细胞病理变化轻微或不显著，细微变化也可由于传代、换液而缓解，因此易被忽视。实际上细胞已受到各方面潜在的影响，如细胞变性、DNA合成受影响等。个别严重者，可致细胞增殖缓慢，甚至从培养器皿脱落。,为确定有无支原体污

23、染可做如下检测：,相差显微镜检测 将细胞接种于事先放置于培养瓶内的盖玻片上，24h后取出，用相差油镜观察，支原体呈暗色微小颗粒位于细胞表面和细胞之间，类似布朗运动。 荧光染色法 荧光染色用能与DNA特异性结合的荧光染料Hoechst 33258，可使支原体内含有的DNA着色，据此可检测支原体。固定细胞以Hoechst 33258染色，然后置荧光显微镜下观察。镜下支原体为散在于细胞周围或附于细胞膜表面的亮绿色小点。,电镜检测 用扫描电镜方法简便快速，也可以利用透射电镜。 DNA分子杂交检查或支原体培养等方法 检出率高，但方法较复杂。,（2）病毒污染,传代细胞带有潜伏病毒。Hela-HPV18,H

24、SV,逆转录病毒等以前病毒形式整合细胞DNA。可通过细胞直接观察（血细胞吸附、包涵体等）、动物接种、异种组织培养物生长、电镜观察、免疫学方法及PCR方法检查,污染的预防,防止污染，预防是关键 1、器皿准备中的预防 2、操作前的预防：超净工作台，培养皿，培养液，操作者 3、操作过程中的预防：瓶口不能于工作台风向逆向；火焰烧灼灭菌，专管专用，试管斜位，不要交谈，完毕后整理、清扫,污染排除,1、抗生素排除：联合用药，预防性应用比污染后使用更好 2、加温除菌：41oC，510h 3、动物接种 4、与共培养,体外培养的基本组织,上皮组织 内皮细胞血管内皮细胞、淋巴内皮细胞 单层柱状上皮细胞胃粘膜上皮细胞

25、，肠粘膜上皮细胞，假复层纤毛柱状上皮细胞 复层上皮细胞表皮细胞，食管粘膜上皮细胞,结缔组织,成纤维细胞 细胞：腹腔，肺泡，肥大细胞，血细胞，淋巴细胞，软骨细胞，骨细胞 脂肪细胞,肌肉组织,心肌细胞 平滑肌细胞 骨骼肌细胞 神经组织，神经元，神经胶质细胞，少突胶质细胞，Schwann细胞 脂肪细胞,除此之外，尚有器官培养（胚胎干、神经干、造血干、间光质干、表皮组织干、胰岛干细胞培养）等技术,人脐血管内皮细胞（凋亡）,人脐血管内皮细胞,食管癌细胞株表达MMP2 (PI复染) 培养的天数：2d;细胞倍增时间-24h左右；放大倍速：倒置荧光显微镜，100倍；培养基种类：1640+10%胎牛血清；细胞状

26、态与特征简述:细胞贴壁生长； 图片目的：鉴定食管癌细胞表达MMP-2(胞浆中绿色荧光)，细胞核红色荧光。,新生SD大鼠肺成纤维细胞（原代） 培养的天数：48h 放大倍速：倒置显微镜 X40 培养基种类：RPMI1640+10%小牛血清 细胞状态与特征简述:细胞呈梭形，有伪足，边缘清晰整齐，贴壁生长,胰岛细胞株RINm5f 培养的天数：4d 放大倍速：倒置显微镜10*倍； 养基种类：DMEM+10%胎牛血清 细胞状态与特征简述:细胞贴壁生长,大黄鱼肾细胞系PCK： cell line：PCK； passage：75； microscope： X10media：M199+10%FNS staini

27、ng: Gimsa,人bmsc原代细胞 培养的天数：3d 放大倍数：倒置显微镜 放大40倍 培养基种类：DMEM+10%胎牛血清；细胞状态与特征简述:少数细胞贴壁变形，呈梭形，体积较大，与周围细胞间有明显的透光区，以后呈克隆样生长，低倍镜下可见梭形镂空现象,Molt4细胞-成人T淋巴细胞白血病细胞株 细胞的天数：2d; 细胞倍增时间-24h左右； 放大倍数：倒置显微镜高倍镜 的放大倍数 培养基种类：1640+10%胎牛血清；5.细胞状态与特征简述:细胞呈葡聚状生长，悬浮细胞，聚集呈团，如单个散开分布示状态不佳,单核巨噬细胞（未刺激状态） 细胞种类：小鼠腹腔分离的单核巨噬细胞；培养的天数：24h

28、 放大倍数：倒置显微镜 X10 培养基种类：RPMI1640+10%胎牛血清； 细胞状态与特征简述:细胞呈圆形，边缘清晰整齐，贴壁生长。,人PBMC（PHA活化剂刺激16h后）： 细胞种类：人PBMC 养的天数：36h 放大倍数：倒置显微镜 X10 培养基种类：RPMI1640+10%胎牛血清；细胞状态与特征简述:淋巴细胞母细胞化并聚集.,幼兔骨髓基质干细胞（原代）： 细胞种类：幼兔骨髓基质干细胞 培养的天数：五天后 放大倍数：倒置显微镜 X40培养基种类：DMEM+20%胎牛血清细胞状态与特征简述:细胞呈梭形，有伪足，边缘清晰整齐，贴壁生长,兔气管纤毛上皮细胞（原代培养）： 细胞种类：纤毛上

29、皮细胞 培养的天数：7天； 放大倍数：倒置显微镜 X200； 培养基种类：DMEM+10%小牛血清； 细胞状态与特征:纤毛细胞呈圆形或椭圆形，有清晰纤毛覆盖， 摆动良好。,人PBMC（经EB病毒转化后的淋巴母细胞）： 细胞种类：人PBMC；培养的天数：2 weeks； 放大倍数：倒置显微镜 X10 培养基种类：RPMI1640+15%胎牛血清（Hyclone公司)； 细胞状态与特征简述:淋巴细胞母细胞化并聚集.,三、 应用,生物体是一个高度统一的整体，而细胞生物学的主要对象是生物体内的各种细胞，很显然，在整体条件下研究单个细胞或某一细胞群在体内（in vivo）的功能活动是非常困难的。细胞培养

30、的意义主要在于两点，其一是人工培养条件易于改变并能严格控制，便于研究各种因素对细胞的结构、功能和各种生命活动规律的影响；其二是细胞在体外培养环境中可以长期存活和传代，可以比较经济地、大量地提供在同一时期、条件相同、性状相似的细胞作为实验样本。因此，大量生物医学研究工作依赖于细胞培养，许多重要的发现都基于培养细胞的工作。,细胞培养技术也存在着一定局限性，主要是细胞离体以后失去与体内环境的密切联系，失去了神经体液的调节和不同细胞间的相互作用，特定分化基因的表达减弱或停止，而进化中保守的细胞生长和增殖活动却可维持，遂使体内外细胞出现了差异，这是应用细胞培养技术应该注意的问题。,细胞培养技术除经典地用

31、于细胞形态结构、功能和细胞活动研究以外，还成为近年发展起来的细胞工程技术的基础，也就是说细胞培养技术重要应用就是各种细胞工程技术。因此在此对这些相关技术作一简介。 一般地，细胞工程指应用各种手段对细胞不同结构层次(整体、细胞器、核、基因等)进行改造，如进行细胞融合、核移植、基因转移等，以获得具有特定生物学特性的细胞。,（一）细胞融合,在细胞自然生长情况下，或在其他人为添加因素存在下，使同种细胞之间或不同种类细胞之间相互融合的过程，即为细胞融合（cell fusion）。通过细胞融合，可将来源于不同细胞核的染色体结合到同一个核内，结果形成一个合核体的杂种细胞。在实际工作中常采用各种促融合手段，包

32、括病毒类融合剂如仙台病毒、化学融合剂如聚乙二醇（PEG）及电激融合法等。,在进行细胞融合反应和适当时间的培养后，需要通过一定方法对两种亲本细胞融合产生的具有增殖能力的杂种细胞进行筛选。筛选方法主要包括药物抗性筛选、营养缺陷筛选和温度敏感性筛选等。,细胞融合最典型的应用是单克隆抗体技术。1975年Koehler和Milstein将用绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞和体外培养能长期繁殖的小鼠骨髓瘤细胞融合，获得了具有两种亲本细胞特性的杂交细胞，即既能在培养条件下长期生长增殖，又能分泌特异的抗绵羊红细胞的抗体的B淋巴细胞杂交瘤。细胞融合技术的发展和骨髓瘤细胞株的建成促成了B细胞杂交瘤技术的建立和单克隆抗体技术的成功。,（二）核移植,细胞核移植（nuclear transfer）是指将一个双倍体的细胞核（可来自胚胎细胞或体细胞）移植到去核的成熟卵母细胞或受精卵中。重组的卵细胞可以植入母体，并能发育为与供核细胞基因型相同的后代，因此又称为动物克隆技术。1997年诞生的克隆羊“多利”就是体细胞核移植技术的产物。,核移植技术首先是选取合适的受体去核卵细胞和供体核。目前均以发育至减数分裂中期II的成熟卵母细胞为受体，供体核则可以采用胚胎细胞、未分化的原始生殖细胞、胎儿细胞乃至高度分化的成年动物细胞。核质融合一般是将获得的核转移到已经人工去