聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤

1、聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤一、制胶前的准备1、玻璃板的准备用洗涤剂将玻璃板反复擦洗，然后用清水冲洗干净，待玻璃板晾干后，将1mm塑料薄片沾少许清水，使其贴在玻璃板上，然后将另一块凹行玻璃板与原玻璃板紧贴。2、垂直平板支架的安装将准备好的玻璃板，放入垂直支架内，两侧用钢夹使其固定，钢夹的高度不要超过凹行玻璃的凹口处为宜，两侧选用力度大小适中、对称的钢夹。3、玻璃板的密封将1%琼脂糖用微波炉加热融化后，倒入支架板底槽中，使其密封即可，然后用吸管吸取少量琼脂溶液，沿玻璃板两边的缝隙内加入，使其密封，待其冷却凝固后备用。二、凝胶的制备1、30%的丙烯酰胺溶液的配制（1L）配方：丙烯酰胺（Acr）290

2、g 甲叉双丙烯酰胺（Bis）10g步骤：称取样品，倒入烧杯中用蒸馏水定容至1L将烧杯置于搅拌器上，使溶液充分溶解至透明将完全溶解的溶液分多次过滤到棕色容器中保存备用2、10TBE溶液的配制（1L）配方：Tris：108g；硼酸：55g ；EDTANa：7.44g步骤：称取各成分至烧杯用蒸馏水定容至1L用玻璃棒搅拌至溶剂完全溶解分瓶倒装待用3、PAGE凝胶的制备（一块胶为例）配方：30%的丙烯酰胺溶液10ml ; 10TBE溶液4ml；双蒸水16ml;20%的过硫酸铵（AP）200ul;TEMED溶液20ul步骤：将各成分称量好之后混合好以备灌胶4、灌胶把垂直支架倾斜30，将配好的PAGE凝胶溶

3、液沿凹形玻璃平口处缓缓倒入至距平口7mm处为宜，倒入过程中要避免气泡的产生，发现有气泡产生时，要待气泡消失后再倒入。灌胶完成后，用枪吸取少量水密封胶口，压平胶面。当胶面与水之间有一条明显的界限时，表示凝胶已凝固，可以开始点样电泳。三、点样及电泳1、0.5TBE缓冲溶液的配制 量取950ml的蒸馏水，然后加50ml的10TBE溶液至1000ml处，装瓶摇匀，备用。2、垂直平板电泳槽的安装将制作好的胶放入垂直电泳槽内，凹形玻璃向内侧。选择合适的梳子，轻轻插入玻璃板内，梳子底部与胶面刚好接触为宜。将插好梳子的玻璃板紧贴电泳槽的硅胶密封圈，用钢夹使其固定。倒入0.5TBE缓冲溶液于电泳槽内，以刚好淹没

4、凹形玻璃平口为宜。3、点样用微量移液器吸取1ul的溴酚蓝溶液，根据PCR产物量大小吸取适量样品，点入胶孔内即可。每次加样前，微量移液器要用蒸馏水清洗，以避免交叉污染。为了确保各个胶孔之间都相互隔离，在点样之前可先吸取少量的溴酚蓝点入胶孔两端，看是否有渗漏现象，如果有渗漏现象，要重新安装梳子。每块胶都要点上maker标记。4、电泳点样结束后，接通电源，调节电压至300V，90min，时间电泳时间根据PCR产物分子量适当延长。四、染色、显影1、染色液、显色液的配制染色液：0.1%AgNO3。AgNO3 1g 加水至1L 溶解待用。显色液：2%NaOH。NaOH 20g 加水至1L溶解待用2、取胶把电泳完成后的玻璃板取下，小心拔出梳子揭去凹形玻璃，去掉底部的琼脂凝胶，小心将胶揭下，放入染色槽中3、染色将胶用蒸馏水冲洗2次，倒入适量的染色液，以淹没胶体为宜，计时10min4、显影染色好的胶体，用蒸馏水冲洗2次