食品酶学复习资料

1、绪论1酶学（Enzymology）是研究酶的性质、酶的反应机理、酶的结构和作用机制、酶的生物学功能及酶的应用的科学 。酶的定义：具有生物催化功能的生物大分子，可以分为蛋白类酶（P酶）和核酸类酶（R酶）两大类别。2什么是酶工程？酶的生产与应用的技术过程食品酶学：酶工程与食品生物技术相结合而形成的一门应用性很强的学科。食品酶学主要内容： 包括酶的基本知识，酶的分离与纯化以及酶在食品工业中的应用等内容。食品酶学主要任务： 讲授酶学基本理论，酶的分离与纯化以及酶在食品加工和保藏中的应用等内容。3米氏方程：表示一个酶促反应的起始速度与底物浓度关系的速度方程。这个方程称为Michaelis-Menten方

2、程，是在假定存在一个稳态反应条件下推导出来的，其中值称为米氏常数，是酶被底物饱和时的反应速度，为底物浓度。当时，Km等于酶促反应速度达最大值一半时的底物浓度。4酶与底物结合形成中间络合物的理论1. 锁钥假说：认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样。2. 诱导契合假说：该学说认为酶表面并没有一种与底物互补的固定形状，而只是由于底物的诱导才形成了互补形状.3. 酶生物合成的调节机制“操纵子学说”5酶的特点：催化效率高、专一性强、反应条件温和、酶的活性是受调节控制绝对专一性： 指一种酶只能催化一种底物进行反应，这种高度的专一性称为绝对专

3、一性。相对专一性： 一种酶能催化一类结构相似的底物进行某种相同类型的反应，这种专一性称为相对专一性。6酶的系统名称由两部分组成：底物+反应类型7酶分为六类：氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂合酶类、异构酶类、合成酶类1) 氧化还原酶（oxidoreductases）：催化底物的氧化或还原，而不是基团的加成或者去除，反应时需要电子的供体或受体。2) 转移酶（Transferase）催化功能团从一个底物向另一个转移。3) 水解酶（Hydrolase）催化底物的水解反应。4) 裂合酶（Lyase）能催化底物分子开裂成两部分，其中之一含有双键。这类酶催化反应都是可逆的。开裂点可以是碳碳、碳氧或碳氮键

4、。5) 异构酶（Isomerase）催化底物的分子内重排反应，特别是构型的改变和分子内的氧化还原。6) 合成酶（Ligase）能将两个底物连接成一个分子，在反应时由ATP或其他高能的核苷三磷酸供给反应所需的能量。8酶活力定义：是指酶催化反应的能力，它表示样品中酶的含量。酶活力通常以在最适条件下酶所催化的化学反应的速度来确定。酶活力单位：用来表示酶活力的高低。在标准条件下（指温度25，以及最适底物浓度、最适缓冲液离子强度和pH）1min内催化1mol底物转化为产物的酶量为该酶的一个活力单位。这个单位称为酶的国际单位（IU, international unit ）酶的总活力：样品的全部酶活力。

5、。总活力= 比活力 总体积（ml）或 = 比活力总质量（g）比活力: 指每毫克蛋白质所含酶活力的单位数（单位/毫克蛋白）。比活力是酶纯度指标，比活力愈高表示酶愈纯。酶的发酵生产固体培养发酵：培养基以麸皮、米糠等为主要原料，加入其他必要的营养成分，制成固体或半固体的麸曲，经灭菌、冷却后，接入产酶菌株，在一定条件下进行发酵。1固定化细胞：（又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。） 指采用各种方法将细胞固定在水不溶性的载体上，在一定的空间范围内进行生长、繁殖和新陈代谢的细胞。固定化细胞发酵具有显著的优点：（1） 提高产酶能力：固定化细胞的密度较高，反应器水平的生产强度较大，可提高生产能力；（2） 稳定性

6、好，可以反复使用：发酵稳定性好，可以连续使用较长的时间，易于连续化、自动化生产；（3） 提高设备利用率：细胞固定在载体上，流失较少，可在高稀释率的情况下连续发酵，大大提高设备利用率；（4） 产品易分离纯化：发酵液中含菌体较少，利于产品分离纯化，提高产品质量等。固定化细胞发酵的缺点：历史不长；技术要求较高（需要特殊的固定化细胞反应器）；只适用于胞外酶的生产，还存在不少问题待解决。固定化方法：吸附法、共价偶联法、交联法、包埋法、热处理法等。特点：1提高产酶率； 2.可以反复使用或连续使用较长时间； 3基因工程菌质粒稳定，不易丢失；4 . 发酵稳定性好；5缩短发酵周期，提高设备利用率；6产品容易分离

7、纯化；7适用于胞外酶等胞外产物的生产2发酵产酶的细胞必需具备的条件：（1）酶的产量高。高产细胞可以通过筛选、诱变、或采用基因工程、细胞工程等技术而获得。（2）容易培养和管理。要求产酶细胞容易生长繁殖，并且适应性较强，易于控制，便于管理。（3）产量稳定性好。能够稳定用于生产，不易退化。 （4）利于酶的分离纯化。产酶细胞及杂质易于和酶分离。（5）安全可靠，无毒性。细胞及代谢物安全无毒，不会影响生产人员和环境，也不会对酶的应用产生不良影响。3常用的产酶微生物：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、黑曲霉、青霉、链霉菌、啤酒酵母大肠埃希氏菌（Escherichia coli）大肠杆菌，简称E.coli 革兰氏阴性菌

8、枯草芽孢杆菌 革兰氏阳性菌革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色4诱变的方法有：物理诱变（紫外线、X-射线、-射线、快中子等）； 化学诱变；生物学；复合诱变；空间技术诱变。5培养基：指人工配制的用于细胞培养和发酵的各种营养物质的混合物。培养基的组分一般包括碳源、氮源、无机盐和生长因素，产酶促进剂，阻遏剂等。碳源：指能够向微生物提供组成细胞物质或代谢产物（酶）中碳骨架的营养物质。可以作为微生物碳源的物质很多（糖类）如葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、糖蜜等；各种淀粉类农作物，如山芋粉、玉米粉、麸皮、米糠等石油中的各种烷烃、甲烷等含碳氢元素的化合物；乙醇、乙酸等有机醇、酸类，也可作为碳源。碳源的选择：考虑对

9、酶生物合成的影响；根据微生物营养要求的不同来选择；原料的供求情况及经济实用性；常用碳源：淀粉及其水解物等。6pH的调节控制pH变化原因：不同细胞生长繁殖最适pH；发酵产酶最适pH；调控pH可改变各种酶间的产量比例；细胞代谢引起pH变化。pH调控方法：改变培养基组分或比例；使用缓冲溶液稳定pH；添加适宜的酸、碱溶液。7温度的调节控制温度变化原因：不同微生物的最适生长温度有差别；产酶最适温度与细胞生长最适温度有所不同。调控方法：生产中常采用分段控温技术；温度调节一般采用热水升温、冷水降温方法。8控制阻遏物浓度：有些酶的生物合成受到某些阻遏物的阻遏作用，结果导致该酶的合成受阻或者产酶量降低。为了提高

10、酶产量，必须设法解除阻遏物引起的阻遏作用。例如：-半乳糖苷酶受葡萄糖引起的分解代谢物阻遏作用。在培养基中存在葡萄糖时，即使有诱导物存在，-半乳糖苷酶也无法大量生成。只有在不含葡萄糖的培养基中或者培养基中葡萄糖被细胞利用完以后，诱导物的存在才能诱导该酶大量生成。9通过动物细胞培养主要用于生产下列功能蛋白质：医学(1) 疫苗：脊髓灰质炎（小儿麻痹症）疫苗、牲畜口蹄疫疫苗、风疹疫苗、麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、黄热病疫苗、狂犬病疫苗、肝炎疫苗等。(2) 激素：催乳激素、生长激素、前列腺素、促腺性激素、淋巴细胞激素、红细胞生成素、促滤泡素、胰岛素等。(3) 多肽生长因子：神经生长因子、成纤维细胞生长因子、表

11、皮生长因子、纤维黏结素(4) 酶：胶原酶、纤维酶原活化剂、尿激酶等。(5) 单克隆抗体：通过杂交瘤细胞等动物细胞培养生产各种单克隆抗体。(6) 非抗体免疫调节剂：干扰素、白细胞介素、集落刺激因子等。酶的分离与纯化1. 氨基酸分类：l 非极性氨基酸（疏水氨基酸）8种 丙氨酸（Ala）缬氨酸（Val）亮氨酸（Leu）异亮氨酸（Ile）脯氨酸（Pro）苯丙氨酸（Phe） 色氨酸（Trp）蛋氨酸（Met） l 极性氨基酸（亲水氨基酸）： 极性不带电荷：7种 甘氨酸（Gly）丝氨酸（Ser）苏氨酸（Thr）半胱氨酸（Cys）酪氨酸（Tyr）天冬酰胺（Asn）谷氨酰胺（Gln） 极性带正电荷的氨基酸（碱性

12、氨基酸） 3种 赖氨酸（Lys）精氨酸（Arg）组氨酸（His） 极性带负电荷的氨基酸（酸性氨基酸） 2种 天冬氨酸（Asp）谷氨酸（Glu） .氨基酸名称及简写：甘氨酸 Glycine Gly G 丙氨酸 Alanine Ala A 缬氨酸 Valine Val V 亮氨酸 Leucine Leu L 异亮氨酸 Isoleucine Ile I 脯氨酸 Proline Pro P 苯丙氨酸 Phenylalanine Phe F 酪氨酸 Tyrosine Tyr Y 色氨酸 Tryptophan Trp W 丝氨酸 Serine Ser S 苏氨酸 Threonine Thr T 半胱氨酸

13、Cystine Cys C 蛋氨酸 Methionine Met M 天冬酰胺 Asparagine Asn N 谷氨酰 Glutarnine Gln Q 天冬氨酸 Asparticacid Asp D 谷氨酸 Glutamicacid Glu E 赖氨酸 Lysine Lys K 精氨酸 Arginine Arg R 组氨酸 Histidine His H2连接方式：肽键 磷酸二酯键 糖苷键3乳糖操纵子：4.细胞破碎：细胞破碎是通过各种方法使细胞外层结构破坏的技术过程。为什么细菌细胞不易破碎：5.细胞破碎方法： 机械破碎法 化学破碎法 酶促破碎法 物理破碎法通过温度、压力、声波等各种物理因素

14、的作用使组织细胞破碎的方法，称为物理破碎法。物理破碎法多用于微生物细胞的破碎温度差破碎法 超声波破碎法 压力差破碎法6.相对离心力（RCF）是指颗粒所受到的离心力与地心引力之比值。RCF表示为：RCF = F c /F g = 1.1210 -5 . n 2 . rF c ：离心力 F g ：地心引力n：转子每分钟转数（r/min） r：旋转半径（cm）离心力的大小与转速的平方以及旋转半径成正比。在转速一定的条件下，颗粒距离离心轴越远，其所受的离心力越大。在离心过程中，随着颗粒在离心管中移动，其所受到的离心力也在变化。一般离心力的数据是指其平均值，即在离心溶液中点处颗粒所受的离心力。78. 微

15、滤，超滤，反渗透9.等电点沉淀法：利用两性电解质在等电点时溶解度最低以及不同的两性电解质具有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法。原理特点 溶液的pH值等于溶液中某两性电解质的等电点时，该两性电解质分子的净电荷为零，分子间的静电斥力消除，使分子能聚集在一起而沉淀下来。 由于在等电点时两性电解质分子表面的水化膜仍然存在，使酶等大分子物质仍有一定的溶解度，从而使沉淀不完全。所以在实际使用时，等电点沉淀法往往与其他方法一起使用。 在酶的沉淀分离中，等电点沉淀法经常与盐析沉淀、有机溶剂沉淀和复合沉淀等一起使用。有时单独使用主要是用于从粗酶液中除去某些等

16、电点相距较大的杂蛋白。 在加酸或加碱调节pH值的过程中，要一边搅拌一边慢慢加进，以防止局部过酸或过碱而引起酶的变性失活。10.层析分离： 又称为色谱分离法，是利用混合液中各组分的理化性质（分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分以不同比例分布在两相中。其中一个相是固定的，称为固定相；另一个相是流动的，称为流动相。当流动相流经固定相时，各组分以不同的速度移动，从而使不同的组分分离纯化。 层次分离法是近40年来研究开发的用以分离酶等生物活性蛋白质以及多肽、核酸、多糖等生物大分子物质的一种新技术。11.层析分离的优缺点： 色谱分离法的优点：分离效率高，设备简单，操

17、作方便，条件温和，不易造成物质变性等优点，操作方法和条件的多样性使色谱分离能适用于多种物质的提纯。 色谱分离法的缺点：处理量小，操作周期长，不能连续操作，因此主要用于实验室中。12根据分离的机理，色谱法可以分为： 吸附色谱法利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离； 分配色谱法利用各组分在两相中的分配系数不同而使各组分分离； 离子交换色谱法利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的； 凝胶色谱法以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离； 亲和色谱法利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分

18、子分离纯化； 层析聚焦法将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离。13.离子交换层析： 离子交换层析是利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。 离子交换剂：含有若干活性基团的不溶性高分子物质，通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而制成。14凝胶层析定义：又称分子筛层析、凝胶过滤或分子排阻层析，是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。凝胶种类： 葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶原理：层析柱中装有多孔凝胶，当含有各种组分的

19、混合溶液流经凝胶层析柱时，各组分在层析柱内同时进行两种不同的运动。一种是随着溶液流动而进行的垂直向下的移动，另一种是无定向的分子扩散运动（布朗运动）。 大分子物质由于分子直径大， 不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。 较小的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进出于一个个颗粒的微孔内外，这就使小分子物质向下移动的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各组分。15.亲和层析定义：是近几年发展起来的并有效地应用于分离纯化生物活性大分子的一种新技术。利用生物分子与配基之间所具有的可逆的亲和力，使生物分子分离纯化的层析技术。基本原理：利用生物分子间酶与辅酶、酶与底物、抗原

20、与抗体、激素与受体等具有较高专一性且能可逆形成酶-配基络合物。将这类配基(Ligand） 偶联固定于待分离纯化系统的溶液中，便可从中把待分离纯化的目的物质“抓”出来。配基条件：（1） 配基与酶要有较强的亲和力。 因为吸附和洗脱都由这种力来决定。若要纯化某种酶，则要加入对此酶有专一亲和力的物质，如底物类似物、抑制剂、辅助因子、效应剂、辅酶等。（2） 配基本身应具有供偶联固定用的活泼基团，同时与载体结合后，不应影响或破坏配基与酶间的相互作用。（3） 配基应具有一定的偶联量。 其配基偶联量过高或过低均不适宜，前者可造成洗脱困难，也会造成空间障碍和非专一性吸附，后者分离效果不佳。一般配基偶联量 1-2

21、0mol/mL膨润胶较为合适。16.酶的结晶方法： 酶在结晶时，酶液应达到一定的浓度。浓度太低则无法析出结晶。 一般来说，酶的浓度越高，就越容易结晶。但浓度过高时，会形成许多小晶核，结晶小，不易长大。故此结晶时应控制好酶液浓度。 在结晶过程中还要控制好温度、 pH值、离子强度等结晶条件。 酶结晶的方法多种多样。其主要目的是为了使母液中酶的溶解度慢慢降低，使处于稍微过饱和状态，而使酶析出结晶。酶的分子修饰与模拟1.酶的分子修饰： 通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的催化特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。2.天然酶在应用中的限制因素： 容易变性失效： 一般经不起高温、强酸、强碱、

22、有机溶剂及时间等的考验； 作为异体蛋白在体内难于吸收、易引起免疫反应和被识别降解； 酶的活性、作用专一性和最适条件不一定能适应实际生产工艺要求。3.核苷酸链剪切修饰：在核苷酸链的限定位点进行剪切，使酶的结构发生改变，从而改变酶的催化特性的方法。4.氨基酸置换修饰：将酶分子肽链上的某一个氨基酸置换成另一个氨基酸，则会引起酶蛋白化学结构和空间构象的改变，从而改变酶的催化特性和功能的修饰方法。v 通过氨基酸置换修饰，可以提高酶的催化效率、 增加酶的稳定性以及改变酶的催化专一性，更有利于酶的应用。v 氨基酸置换修饰可以用化学修饰法进行。但现在常用的是 定点突变技术。l 寡核苷酸引物指导的定点 突变(

23、(Kunkelsmethod) )原理：体利用噬菌体M13 的单链化与双链化互变。优点：很好的普适性，可改变、添加或删除原基因中的核苷酸或核苷酸片段5. 蛋白质空间结构（注意化学键、结合键）：酶的固定化1、 酶的固定化方法：通常采用的固定化方法可大体概括为： 吸附法、共价结合法、交联法、包埋法和热处理法等。2、 共价结合法：特点：p 优点： 酶与载体结合牢固，不会轻易脱落，可连续使用。p 缺点： 反应条件较激烈，易影响酶的空间构象而影响酶的催化活性。3、 交联法：定义：利用双功能或多功能试剂在酶分子间进行交联反应，制备固定化酶的方法。常用试剂：戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等双功能试剂

24、。特点：优点： 操作简便，结合牢固，可长时间使用。p 缺点： 交联反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较大，且制成的固定化酶颗粒较小，机械强度也较低。4、 包埋法：v 定义：将酶包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法。常用载体：琼脂、海藻酸钠（CaCl2）、卡拉胶、明胶、聚丙烯酰胺、火棉胶等。根据载体材料和方法的不同，包埋法可分为：凝胶包埋法、半透膜（微胶囊）包埋法。特点：优点：条件较温和，操作简便，对酶活性影响较小；p 缺点：不利于大分子底物和产物的扩散进出。凝胶包埋法：5 、热处理法v 定义：将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内而制得。v 特点：只适用

25、于热稳定性较好的酶的固定化。p 热处理时，要严格控制好加热温度和时间，以免引起酶的变性失活。v 例如：链霉菌细胞中葡萄糖异构酶的固定化，可采用6065下处理15min，葡萄糖异构酶将全部固定在菌体内。6、 固定化酶的性质：1、稳定性提高 2、最适温度3、最适 Ph 4、底物特异性5、活性：通常是降低的最适pH：载体性质对最适pH值的影响：p 载体带负电荷，则制得的固定酶最适pH向碱性一侧偏移；p 载体带正电荷，则制得的固定酶最适pH向酸性一侧偏移；p 载体不带电，则制得的固定酶最适pH一般不改变。产物性质对最适pH值的影响（考虑载体对产物的扩散阻碍）：p 产物为酸性时，固定化酶的最适pH要比游

26、离酶高一些；p 产物为碱性时，固定化酶的最适pH要比游离酶低一些；p 产物为中性时，最适pH一般不改变。7、 细胞固定化：通过各种方法将细胞与水不溶性的载体结合，制备固定化细胞的过程。固定化细胞： 固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞称为固定化细胞。固定化细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，所以又称为固定化活细胞或固定化增殖细胞。微生物细胞、植物细胞和动物细胞都可以制成固定化细胞。酶反应器1、 常见的酶反应器类型：按结构区分 搅拌罐式反应器(Stirred Tank Reactor, STR) 鼓泡式反应器(Bubble Column Reactor, BCR) 填充床式反应器

27、(Packed Bed Reactor, PBR) 流化床式反应器(Fluidized Bed Reactor, FBR) 膜反应器(Membrane Reactor, MR)按操作方式区分 分批式反应(batch) 连续式反应(continuous)混合形式 连续搅拌罐反应器(Continuous Stirred Tank Reactor, CSTR) 分批搅拌罐反应器(Batch Stirred Tank Reactor, BSTR)2、 各种酶反应器的特点（了解）：酶的工业应用1、 酶在食品工业方面的应用（了解）制糖工业 酶法生产葡萄糖 过去国内外葡萄糖生产通常采用酸法水解，现在大都采用

28、酶法。 原料：淀粉。 酶：-淀粉酶和糖化酶。都要求达到一定纯度，尤其是糖化酶中应不含葡萄糖苷转移酶。通常使用游离酶分批方式，也可采用固定化糖化酶进行连续生产。 工艺流程：果葡糖浆的生产 果葡糖浆是由葡萄糖异构酶催化葡萄糖异构化生成部分果糖而得到的混合糖浆。由于甜度提高，可减少用量，且摄取果糖后血糖不易升高，有一定保健功能。 原料：葡萄糖，一般由淀粉通过酶法水解制得。但需经过层析等方法精制后使用。 酶：葡萄糖异构酶。最适pH可由于来源不同而有所差别；温度不宜超过70。 高果糖浆：通常果葡糖浆含果糖42%左右，若将其中的葡萄糖与果糖分离，将分离出的葡萄糖再进行异构化，如此反复，可得到果糖含量达70

29、%、 90%甚至更高的糖浆，称为高果糖浆。酶与食品安全1、 酶作用产生有毒的和不利于健康的物质： 在生物材料中，酶和底物处在细胞的不同部位，仅当生物材料破碎时，酶和底物的相互作用才有可能发生。 其次，湿度、 pH、温度、辅酶和金属离子等条件也是重要的。 有时底物本身是无毒的，在经酶催化降解后变成有害物质。例如：木薯含有生氰糖苷，虽然它本身并无毒，但是在内源糖苷酶的作用下，产生氢氰酸2、 酶作用导致食品中营养组分的损失：虽然在食品加工中营养组分的损失大多是由于非酶作用所引起的，但是食品材料中一些酶的作用也是不能忽视的。例如：脂肪氧化酶催化胡萝卜素降解而使面粉漂白，显然，此酶在其他食品中也存在。例如：一些蔬菜的加工过程中也参与了胡萝卜素的破坏过程。在蔬菜冻结前的热烫能有效地破坏它所含有的脂肪氧合酶。在食品加工过程中维生素B的损失，也有例子可以说明酶参与了维生素B的破坏过程。例如：在一些用发酵方法加工的鱼制品中，由于鱼和细菌中的硫胺素酶的作用，使这些制品缺少维生素