第四章工业发酵灭菌.ppt

1、1、在发酵生产中，为什么要进行灭菌操作？ 2、为防止杂菌的污染，哪些物品需要灭菌？ 培养基、发酵设备、空气、管道、流加料等 3、什么时候进行灭菌？ 生产菌接种前,常用灭菌方法： 干热灭菌、湿热灭菌、射线灭菌（射线、微波等）、化学灭菌（各种化学药品）、过滤除菌； 1、干热灭菌法 灼烧灭菌、在电热或红外线在设备内加热 主要用于保持干燥的物料、器具等. 常用烘箱，灭菌条件为在160下保温1h,原理：根据氧化作用导致微生物死亡。,2、湿热灭菌法,原理：借助蒸汽释放的热使微生物细胞中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，使微生物死亡。 灭菌条件： 121，30min。

2、 适用范围：广泛应用于生产设备及培养基的灭菌 例：高压灭菌锅,湿热灭菌的原理,湿热灭菌的优点：,1）蒸汽来源容易，操作费用低廉，本身无毒 2)蒸汽具有很强的穿透力，灭菌易于彻底 3）蒸汽均有很大的潜热，冷凝后的水分有利于湿热灭菌 4）蒸汽输送可借助本身的压强，调节方便，技术管理容易 缺点： 1)设备费用高 2）不能用于怕受潮的物料灭菌,3、射线灭菌,紫外线、高速电子流的阴极射线、X射线和Y射线 适用范围：无菌室、培养间 问题：是否适于固体、液体物料灭菌？波长范围？,4、化学药品灭菌法,（1）第一大类：表面消毒剂 高锰酸钾溶液：0.10.25%、漂白粉 、75的酒精、新洁尔灭和杜灭芬、甲醛 37

3、、戊二醛、过氧乙酸、焦碳酸二乙酯、酚类。（作用原理？适用范围？） （2）第二大类：抗代谢药物 化学结构与微生物必须的代谢物类似物 例如：磺胺类化合物取代氨基苯甲酸 （3）第三大类：抗生素 不同种类其作用不同，要有针对性选择。 适用范围：环境空气、皮肤及器械的表面消毒,1、湿热灭菌中的相关定义 致死温度：杀死微生物的极限温度。 致死时间；在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间。在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。 微生物的热阻：是指微生物在某一特定条件（主要是温度和加热方式）下的致死时间。 相对热阻是指某一微生物在某条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。,三、加热灭菌的原

4、理,问题,说说芽孢或孢子的热阻要比营养细胞的热阻大的原因？,芽孢或孢子的热阻要比生长期营养细胞的热阻大得多，这是由于芽孢或孢子内吡啶二羧酸含量对热阻的增加有关。另外，芽孢子中蛋白质含水量较营养细胞低（特别是游离水分少），也是芽孢耐热强的一个原因。,芽孢与营养细胞的耐受力，哪个强？,一级反应： 用N表示残留活菌个数，则活菌的减少率（死亡率），与N呈线性关系，即： 式中，K是反应速度常数，对灭菌来讲，是活菌的比热致死速率常数，单位是min-1 ，其值与菌的种类和加热温度有关，需通过实验才能测定。,2、微生物的热致死动力学：对数残留定律,积分边界条件：N0N；t0=0,式中， 灭菌时间（s）； N0

5、 灭菌开始时，培养基中杂菌个数（个）； N 经过灭菌时间后，残存的活菌数（个）。,灭菌时间与哪些因素有关？,0,5,10,25,121,116,110,108,从上述的微生物对数死亡规律可知，如果要达到彻底灭菌，即灭菌结束时残留的活微生物数等于0，则灭菌所需的时间应为无限长，这在实际中是不可能的。 工程上，在进行灭菌的设计时，常认为 N =0.001，即在1000次灭菌中， 允许有一次失败。,3、热致死反应的速度常数K K是表达微生物耐热性的特征常数 ，与微生物的种类和灭菌温度有关。K越小，微生物越耐热。温度越低， K值越小。,例： 在121度，枯草杆菌FS5230的K为0.047s-1，梭状

6、芽孢杆菌PA3679的K值为0.03 s-1 ，请问哪一种微生物更耐热？,培养基灭菌的要求： 达到要求的无菌程度（10-3） 尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中，培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引起的： 培养基中不同营养成分间的相互作用； 对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。,4、灭菌的温度和时间,培养基湿热灭菌需解决的工程问题,将培养基中的杂菌总数N0杀灭到可以接受的总数N（10-3），需要多高的温度、多长的时间为合理。 灭菌温度和时间的确定取决于： 杂菌孢子的热灭死动力学 反应器的形式和操作方式 培养基中有效成分受热破坏的可接受范围,A-比例常数，也称阿累尼乌斯常数，s-1

7、； R-气体常数，8.314J/molK； T-绝对温度，K； E-微生物死亡活化能，J/mol。,如何选择一个既能满足灭菌需要，又可使培养 基的破坏尽可能减小的灭菌工艺条件？,微生物的受热死亡属于单分子反应，其灭菌速率常 数K与温度之间的关系可用阿累尼乌斯公式表示：,（5）,1/T,K（min-1）,K和A的求解：,K-培养基内易被破坏成分的分解速率常数； A-频率常数，也称阿累尼乌斯常数，s-1； R-气体常数，8.314J/molK； T-绝对温度，K； E-培养基成分分解所需活化能，J/mol。,灭菌时，培养基成分分解速率常数K与温度之间的关系也可用阿累尼乌斯公式表示：,当培养基成分从

8、T1上升到T2时，微生物的死亡速率与培养基的分解有如下关系：,即随着温度的上升，微生物的死亡速率常数增加倍数要大于培养基成分的破坏速率的增加倍数。 结论1：当灭菌温度上升时，微生物杀死速率的提高要超过培养基成分的破坏速率的增加。,灭菌时杀死微生物的活化能大于培养基成分的破坏活化能值， 因此：,由此可见，若要减少营养成分的破坏，可升高温度灭菌。,结论2：在灭菌时选择较高的温度、较短的时间，这样便既可达到需要的灭菌程度，同时又可减少营养物质的损失。,问题,灭菌要达到杀死99.99%的细菌芽孢，有两种方法可以采用，一种是118灭菌15min，另一种是128灭菌5min。哪一种方法好，为什么？,答：从

9、理论研究和生产实践都可证明，在灭菌过程中，同时会发生微生物死亡和培养基破坏这两种过程，且这两种过程的进行速度都随温度的升高而加速，但微生物的死亡速率随温度的升高更为显著。因此，对于同一灭菌效果，选择较高的温度、较短的时间，这样便既可达到需要的灭菌程度，同时又可减少营养物质的损失。,四、影响培养基灭菌的其他因素,培养基成分、pH值、培养基中的颗粒、泡沫,五、分批灭菌和连续灭菌,（一）、分批灭菌,240,160,120,80,时间（min),0,50,100,150,温度,升温,冷却,保温,发酵罐,过程包括：升温（后期灭菌）、保温和冷却（初期灭菌）等三个阶段。 各阶段对灭菌的贡献：20%、75%、

10、5% 右图为培养基间歇灭菌过程中温度变化情况。,1、定义：将配制好的培养基同时放在发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行加热灭菌的过程，通常也称为实罐灭菌。（常用）,2、灭菌时间的计算,如果不计升温阶段所杀灭的菌数，把培养基中 所有的菌均看作是在保温阶段（灭菌温度）被 杀灭，这样可以简单地利用右式， 粗略地求 得灭菌所需的时间：,例：有一发酵罐内装40m3培养基，在121 温度下进行实罐灭菌。原污染程度为每1mL 有2*105个耐热细菌芽孢，121度时灭菌速度常数为1.8min-1。求灭菌失败机率为0.001时 所需要的灭菌时间。,解： N0=40 106 2 105=8 10

11、12（个）、 Nt=0.001（个） K= 1.8min-1,但是实际上，培养基在加热升温时（即在升温阶段）就会有部分菌被杀灭，特别是当培养基加热到100 以上，这个作用较为显著。因此，保温灭菌时间实际上比上述计算的要短。严格地讲，在降温阶段也有杀菌作用，但降温时间短，在计算时一般不考虑。,3、分批灭菌的操作,分批灭菌是在所用的发酵罐或其他培养装置中进行的，它是在配制罐中配好培养基后，通过专用管道输入发酵罐等培养设备中，然后开始灭菌。在进行培养基的间歇灭菌之前，通常先将发酵罐等培养装置的分空气过滤器进行灭菌，并且用空气将分过滤器吹干。 开始灭菌时，应先放去夹套或蛇管中的冷水，开启排气管阀，通过

12、空气管向发酵罐内的培养基通入蒸汽进行加热，同时，也可在夹套内通蒸汽进行间接加热。当培养基温度升到70 左右时，从取样管和放料管向罐内通入蒸汽进一步加热，当温度升至120 ，罐压为1*105Pa（表压）时，打开接种、补料、消泡剂、酸、碱等管道阀门进行排气，当然在保温过程中，应注意凡在培养基液面下的各种进口管道都应通入蒸汽，而在液面以上的其余各管道则应排放蒸汽，这样才能不留死角，从而保证灭菌彻底。,3、分批灭菌的操作,保温结束后，依次关闭各排汽、进汽阀门，待罐内压力低于空气压力后，向罐内通入无菌空气，在夹套或蛇管中通冷水降温，使培养基的温度降到所需的温度，进行下一步的发酵和培养。 间歇培养特点：由

13、于培养基的间歇灭菌不需要专门的灭菌设备，投资少，对设备要求简单，对蒸汽的要求也比较低，且灭菌效果可靠，因此，间歇灭菌是中小型生产工厂经常采用的一种培养基灭菌方法。,4 保证间歇灭菌成功的要素 内部结构合理(主要是无死角)，焊缝及轴封装置可靠，蛇管无穿孔现象 压力稳定的蒸汽 合理的操作方法。,发酵罐的接管图,4、分批灭菌的注意事项 1）各路蒸汽进口要畅通，防止短路逆流；罐内液体翻动要剧烈，以使罐内物料达到均一的灭菌温度。 2）排气量不宜过大，以节约蒸汽 3）灭菌将要结束时，应立即引入无菌空气以保持罐压，然后开夹套或蛇管冷却，以避免罐压迅速下降产生负压而吸入外界空气，或引起发酵罐破坏。 4）在引入

14、无菌空气前，罐内压力必须低于过滤器压力，否则培养基将倒流入过滤器。,（二）、连续灭菌,1、定义：,将配制好的培养基在向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、保温和冷却而进行灭菌。,连续灭菌的基本设备一般包括（1）配料预热罐，将配制好的料液预热到60-70 ，以避免连续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声；（2）连消塔，连消塔的作用主要是使高温蒸汽与料液迅速接触混和，并使料液的温度很快升高到灭菌温度（126-132 ）；（3）维持罐，连消塔加热的时间很短，光靠这段时间的灭菌是不够的，维持罐的作用是使料液在灭菌温度下保持5-7min，以达到灭菌的目的；（4）冷却管，从维持罐出来的料液要经

15、过冷却排管进行冷却，生产上一般采用冷水喷淋冷却，冷却到40-50 后，输送到预先已经灭菌过的罐内。,连续灭菌的基本设备有哪些 ？,问题,2、连续灭菌的优点： 1）可以采用高温短时灭菌； 2）发酵罐利用率高； 3）蒸汽负荷均衡； 4）热效率高； 5）可采用自动控制，降低劳动强度；,3、连续灭菌时间的计算,如果不计升温阶段所杀灭的菌数，把培养基中 所有的菌均看作是在保温阶段（灭菌温度）被 杀灭，这样可以简单地利用右式， 粗略地求 得灭菌所需的时间：,4、连续灭菌流程,六、间歇灭菌与连续灭菌的比较,加热器、维持罐（管）和冷却器以及发酵罐等都应先进灭菌,由表可见，无论在理论上或者在实践上，与间 歇灭菌

16、过程相比，连续灭菌的优点十分明显。因此， 连续灭菌越来越多地被用培养基的灭菌。,七、培养基与设备、管道灭菌条件 1、灭菌锅内灭菌 2、种子培养基实罐灭菌 3、发酵培养基实罐灭菌 4、发酵培养基连续灭菌 5、消泡剂灭菌 6、补料实罐灭菌 7、尿素溶液灭菌,谢谢！,例3-1,例3-1有發酵培養基40m3 ，原始污染程度為105個菌/mL，要求無菌程度Ns為10-3個菌/批，若滅菌溫度125時滅菌速度常數為1 min-1，求所需要滅菌時間。 解：已知N0=40106105=41012個菌/批 Ns=10-3個菌/批 K=1 min-1 將上述數據代入 =152.3030.602=20.8 (min),例3-2,例3-2假定滅菌溫度為120，試比較嗜熱脂肪芽孢桿菌死亡速率常數ks和維生素B1的分解速率常數kB。 解：已知，嗜熱脂肪芽孢桿菌的活化能 E3=283460 (J/mol) 阿累尼烏斯常數As=1.061036(min-1) 氣體常數R=8.314J/(molK) 熱力學溫度T=120+273=393 代入式(3-4)中：Ks=1.061036 =0.024 (min-1) 已知維生素B1的活化能EB=92114 (J/mol) 阿累尼烏斯常數AB