分子标记辅助选择育种

1、第17章分子标记辅助选择育种传统的繁殖主要取决于植物的表型选择(Phenotypiealselection)。环境条件、基因间相互作用、基因型和环境相互作用等诸多因素都会影响表型选择效率。例如，抗病鉴定受发病条件、植物生理状态、评价标准等影响。质量，产量等数量特性的选择，鉴定工作更加困难。培育优良品种通常需要7至8年，甚至10年以上。提高选择效率的方法是育种工作的关键。育种者继续探讨遗传标记在长期繁殖实践中的使用，提高繁殖的选择效率和繁殖预知能力。基因标记包括形态标记、细胞学标记、生化标记和分子标记。棉花的芽黄、番茄的叶型、抗TMV的矮黄标记、水稻紫色叶鞘等形态特征标记在育种工作中经过了一定的

2、应用。非整体配体、缺失、逆位、易位等染色体数、基于结构变异的细胞学对小麦等作物的基因定位、连锁图谱、染色体工程、外源基因识别有重要作用，但很多作物很难得到这样的标记。生化标记主要利用isoenzyme和储存蛋白等基因的表达产物，在一定程度上反映基因型差异。他们应用于小麦、玉米等作物遗传和育种。但是它们多态性低，受植物发育阶段和环境条件及温度、电泳条件等的影响，很难满足遗传育种工作的需求。基于DNA多态性的分子标记目前广泛应用于作物遗传图谱构建、重要农艺性状基因的标记位置、种质资源遗传多样性分析及品种指纹和纯度鉴定等领域，尤其是分子标记辅助选择(molular marker-as-sisters

3、election，MAS)育种更受到关注。第一节分子标记的类型和作用原理一、分子标记的类型和特征根据技术特性，分子标记可以分为三类。第一类是基于分子杂交的DNA标记技术，主要有限制性片段长度多态性标记(RFLP标记)。第二类是基于聚合酶链反应(PCR反应)的多种DNA指纹技术。PCR是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下，根据DNA聚合酶的体外酶反应合成特定DNA片段的第一种方法(1985)。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA的特定结合。PCR反应分变性、复性、扩张三个阶段(图17-1)。变性是指加热，使DNA双螺旋的氢键断裂，双链脱落，形成单链DNA的过程；复性(也称为退

4、火)是温度降低时，单链DNA形成双链的过程，模板分子结构比引物复杂得多，反应系统中引物DNA远高于模板DNA，因此引物及其互补模板易于局部形成混合链。扩展是在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核酸酶3磷酸基质和Mg2存在的条件下，以引物为起点的5-3的DNA链延长。上述三个步骤都是循环，每个循环都可以是下一个循环的模板，在25-30循环后，两个引物之间的特定DNA片段将复制2106-7拷贝的数量。根据PCR，所需的底漆类型可以分为：单引物PCR标记源于随机引物作用下扩增产物长度或序列的变异，随机扩增多态性DNA标记(RAPD)，简单重复序列中间区域标记(1 nter-simple sequueque)

5、双引物选择性扩增PCR标记主要通过引物3段碱基的变化获得多态性，意思是扩增片段长度多态性标记(AFLP)。通过复制、排序构建特殊的双引物的PCR标记包括简单序列重复标记(SSR)、序列特征放大区域(称为Segion、SCAR技术)和顺序标记第三类是单核苷酸多态性(SNP)、基因组核苷酸水平变异的DNA序列多态性，包括单碱基转换、贝拉克、单碱基插入/缺失。Expressed sequences tags，EST是从cDNA库中随机选择克隆并在Singlepasssequence中生成的300到500bp核苷酸片段。分子标记辅助育种中使用的标记主要是RFLP、RAPD、SSR、AFLP、STS等。

6、他们的遗传、体征特征概述在表17-1中。分子标记基于DNA多态性，具有以下优点。稳定的表达，多态性以DNA形式直接表达，没有组织器官，发育时期特异性，环境条件，不受基因相互作用的影响；数量大，理论上遍布全基因组；多态性高，自然界存在很多对立的基因，不需要人为制造特殊的遗传物质。这为大量重要性状的基因紧密连接的标记筛选创造了条件。对目标性状的表现没有不利影响，没有不良性和不可抗力的联系。部分标记遗传方式是空想，识别纯合体和杂子。成本不太高，一般实验室可以进行。对于特定探针或引物，可以导入或自行合成，具体取决于发布的特定序列。二、分子标记的原理和遗传特性(a) RFLP首先，发现了目前使用最广泛的

7、分子标记。这种标记是在20世纪70年代发现的。1980年，人类首先用于构建连锁图。该技术目前广泛应用于动植物连锁图谱制作、重要农艺性状基因的分子标记等。1.RFLP标记法在植物基因组的DNA中进行碱基替换、插入、缺失或重复等，导致任何限制性内切酶(re)酶部位的增加或丢失，都是限制性片段长度多态性的原因。在每个DNA/re组合中，都会产生一个片段，作为特定DNA的独特“指纹”。某些生物基因组DNA被限制性内切酶消化后，可以制造数百万个DNA片段，通过琼脂糖电泳按大小顺序分离，然后根据原始顺序和位置，转移到易于操作的尼龙膜或硝化纤维素膜上。用放射性同位素(如32P)或非放射性物质(如生物素、地高

8、辛等)标记的DNA作为探针，与膜的DNA杂交(即Southern hybrid)，在某个位置的DNA片段与探针顺序相似或同系性高发射自身显影或酶检查可以在其他材料中显示该探针的限制性片段多态性(图17-2)。对于线粒体和叶绿体等较小的DNA分子，有可能通过适当的限制性内切酶直接检测电泳分析后DNA片段的差异，因此不需要南方杂交。RFLP分析探测必须是单一或未使用的。否则，杂交结果将显示为漫射形状，不显示明确识别的条带，观测分析不容易。RFLP探针主要有三种来源：cDNA复制、植物基因组复制(称为RG复制)和PCR复制。2.RFLP标记的特征RFLP标记具有共同的主导特征。共显性标记意味着两个或

9、多个多态性片段在f中表达，两个或多个多态性片段在双亲的分子量不同。它已广泛用于多种生物的遗传分析，尤其是用于制作植物遗传图谱。RFLP标记所需的DNA数量多(5-15 Peng)，测试阶段繁琐，所需的设备和设备多，周期长，检测几个探针的成本高，准备和保管用作探针的DNA克隆很麻烦。检测过程中使用放射性同位素(通常较少)容易造成污染。尽管可以使用非放射性物质显示方法，但价格高，混合信号相对弱，灵敏度比同位素显示低。目前，我们正在努力将高繁殖成本的RFLP标记转换为PCR标记，以便于繁殖。(b) RAPD标记1.RAPD marker的原理Williams等(1990)是根据DNA聚合酶链反应提出

10、的。RAPD标记是随机排列的寡核苷酸短链引物(长度为10核苷酸)通过PCR扩增染色体DNA而得到的长度不同的多态DNA片段。RAPD marker的原理与PCR技术相同，但与传统的PCR反应不同。主要表现在以下三个方面：底漆。一般的PCR反应使用长度一般为20bp(碱基对)左右的引物对。RAPD使用1个引物，长度只有10bp。反应条件。传统的PCR复性温度通常为55 60，RAPD的复性温度约为36 。放大产物。现有PCR产物为特异性扩增，RAPD产物为随机扩增。这样，RAPD反应在初始反应周期中，由于短的随机单引物、低退火温度，确保核苷酸引物和模板的稳定配对，同时允许引物中碱基的随机排列，允

11、许适当的不匹配，从而扩大基因组DNA中引物的随机性，提高基因组DNA分析的效率。还有与RAPD原理相似的AP-PCR(arabitrary priedpolayraechain reaction)。Ap-PCR反应中使用的引物长度与常规PCR反应中的引物相似，但在反应开始阶段退火温度低，允许大规模不匹配，因此可能会发生随机放大。一般在APPCR反应中使用放射性标记，其产物从聚丙烯酰胺凝胶中分离出来，然后通过放射性检测其多态性。2.RAPD marker的特征如果基因组在特定引物结合区发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，PCR产品的增加、缺失或分子量大小可能会发生变化，具体取决于特定引物结合区的

12、分布。PCR产品增加或不足会产生显性RAPD标记。PCR产品的分子量发生变化时，形成共显性RAPD标记，在此部位基因组DNA多态性通过电泳分析检测。RAPD标记通常表现为显性遗传，极少数表现为共同性遗传。显性标记将F1的多态性片段与亲本之一完全相同，可以记住杂交后代中扩增产物的记录是否有，即每个随机扩增多态性片段作为分子地图的一个部位。RAPD引物一般是10个碱基，合成成本较低，引物套装可用于其他作物，并可制作其他作物标准指纹。RAPD易于构建介质资源指纹文件，分析种内遗传多样性和确认品种纯度。所以RAPD也是一个有很大潜力的分子标记。使用DNA放大器，操作自动化，分析量大，在RFLP中消除探

13、针准备、同位素标记、Southern blotting等步骤，分析速度非常快。RAPD分析所需的DNA样本数量较少(通常为5 10 ng)，对DNA质量的要求低于RFLP。另外，RAPD marker可以改为RFLP探针、SCAR、STS等，作为共显性和显性分子标记。RAPD最大的缺点是重复性不好。RAPD marker的实验条件探索和引物选择是非常重要和困难的任务。为此，研究人员需要对各种物种进行大量的勘探工作，以确定各种物种的最佳反应程序模板DNA、引物、Mg2浓度等。只有实验条件标准化，才能提高RAPD标记的再现性。3.scar标记基于RAPD技术，1993、Paran等建议将RAPD标

14、记转换为特定序列放大区域标记，即SCAR标记。其基本原理是，目标DNA通过RAPD分析复制的复制片段两端排列完毕后，根据测序结果设计了长度为18 24bp的引物，普通引物的前10个碱基应包含最初用于RAPD扩增的引物。多态片段在复制前必须先从凝胶中回收。因为Taq酶制作了PCR产品3，最后贴上了a尾巴，有人工设计的复制向量5，末端有突出的t碱基，PCR产品可以有效地复制到载体上。将接合产物转换为大肠杆菌，涂敷板，选择重组克隆，通过测序分析，引物设计，PCR扩增，检测原多态条是否可以扩增。成功转换的标签称为SCAR标签。在SCAR标记中使用的引物，对长、重复性特别放大，对分子育种有效。(c) A

15、FLP荷兰Keygene的科学家Marc &Pieterl993年发明的DNA分子标记。该技术是限制性酶片段的选择性扩增，也称为基于PCR的RFLP。AFLP标记多态性强，一次可以检测100-150个扩增产物，适合绘制品种指纹和遗传多样性的研究。1.AFLP标记的原理首先将基因组的DNA切成双酶。其中一种是酶切频率高的限制性内切酶，另一种是酶切频率低的酶。用酶切频率高的限制性酶消化基因组DNA，是为了使其容易扩增，并能更好地在测序粘合剂中分离适当大小的短DNA片段；后者消化基因组DNA是限制扩增使用的模板DNA片段数量。AFLP扩增数由基因组中酶切频率低的限制性内切酶的耐酶性决定。通过连接酶片

16、段及其粘性末端等人工连接，结合的顺序和相邻的酶识别部位作为PCR反应的引物结合部位，在末端分别添加1 3个选择性碱基，使其特异性扩增，最后通过改性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物。AFLP的原理图如图17-3所示。AFLP分析的基本步骤可以概括为：(1)把基因组DNA切成两种限制性核酸内切酶，同时制成分子量多种随机限制片段，在这些DNA片段的两端连接特定的寡核苷酸连接体(oligonucleotide adapters)。(2)通过联合序列和PCR引物三端识别，筛选和放大限制片段。普通PCR引物用同位素32P或33P表示。(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳分离特定扩增限制片段。(4)电泳凝胶移动吸附在滤纸上，用干胶干燥。(5)在x光照射后几天冲洗胶卷，然后进行结果分析。为了避免AFLP分析中的同位素操作，目前开发了检测AFLP荧光标记、银染色等放大产物的新手段。2.AFLP技术是AFLP标记的特征，它将RFLP稳定性和PCR技术的效率结合在一