第四章(一)...ppt

1、第四章 细胞生物反应器,生物反应器是利用生物催化剂进行化学反应的设备，按照所使用的生物催化剂不同，又可分为酶反应器和细胞生物反应器。 生物反应器和化学反应器的不同： 大多数生物反应器需要不断通入无菌空气。 避免染菌。,第一节 发酵罐,发酵罐是一种重要的生物反应器， 是按照发酵过程的工艺要求，保证和控制各种生化反应条件(T、P、O2、防止杂菌污染)，以促进微生物的新陈代谢，使之能在低消耗下获得较高产量的一种设备。,分类,微生物有好氧和厌氧两大类，培养这两大类微生物的发酵罐有很大的区别。相应地发酵罐可分为以下两种： 1 好氧发酵罐： 氨基酸、有机酸、酶制剂、抗生素和单细胞蛋白均由此方法制得。在生产

2、过程中需通入无菌空气，因此其设备的结构要比厌氧发酵复杂些。,2 厌氧发酵罐 厌氧发酵也称静止培养，因其不需供氧，所以设备和工艺都较好氧发酵简单。严格的厌氧液体深层发酵的主要特色是排除发酵罐中的氧。罐内的发酵液应尽量装满，以便减少上层气相的影响，有时还需充人非氧气体。发酵罐的排气口要安装水封装置，培养基应预先还原。,好氧发酵罐,生产上根据发酵罐通风和搅拌方式的不同可将其分为：机械搅拌式通风发酵罐、自吸式发酵罐、气升式发酵罐和塔式发酵罐。,一、通用式发酵罐,通用式发酵罐是指既具有机械搅拌又有压缩空气分布装置的发酵罐。由于这种型式的罐是目前大多数发酵工厂最常用的，所以称为“通用式”。 目前最大的通用

3、式发酵罐容积约为480m3。,特点,轴封严密，泄漏少 能承受一定压力、温度 搅拌通风装置保证气液充分混合 具有足够的冷却面积 死角少，灭菌彻底 适宜的径高比（高与直径的比值为2.54）,1、几何尺寸,H筒身高度 D罐径 B挡板宽度 HL液位高度 Di搅拌器直径 S两搅拌器间距,2、装料容积,公称容积V0是指圆筒部分容积Vc和底封头的容积Vb之和。 对于椭圆形封头， 对于标准椭圆形封头，,若罐身高径比H/D=a，则 通常装料系数 在生产设计中，根据年产量和发酵周期可得出V，选择适合的装料系数，可确定V0，再根据上式可求出D，最后按照通用式发酵罐各尺寸与D的关系确定其他几何尺寸。,3、结构,(1)

4、罐体 罐体一般由不锈钢制成，应保证无死角、渗漏、积液。,(2)搅拌装置,机械搅拌罐的混合主要是通过机械搅拌来实现。机械搅拌一方面可以使罐内物料混合良好，液体中的固形物保持悬浮状态，有利于固体和营养物质充分接触，便于营养吸收；另一方面，可以打碎气泡，增加气液接触面积，提高气液间的传质速率，加强氧的传递效果及消除泡沫。,搅拌器型式,搅拌装置由安装在一根轴上的多个搅拌浆组成的，它可以使被搅拌的物料产生轴向和径向流动。 常用的搅拌器型式有：旋桨式、涡轮式、锚式和框式等。,旋桨式搅拌器：又称推进式搅拌器。特点：结构简单、安装容易、转速快、循环量大。 锚式和框式搅拌器：叶片大、转速慢、搅动范围大，适合高黏

5、度物质混合。 涡轮式搅拌器：工作原理与双吸式离心泵相似，适合低黏度和中等黏度液体搅拌。 一般情况下同一搅拌轴要配置多个搅拌器，当容积大于15m3时，采用三层搅拌，小于15m3时，采用二层搅拌。,搅拌功率与搅拌效果,通过搅拌将能量作用液体，使达到混合和分散液团的目的。 在消耗相同的功率的条件下，对不同的搅拌目的，应对功率作不同的分配。,若搅拌器功率不变，增大搅拌器直径，则降低搅拌转速，由此翻动量增加、动压头下降；减小搅拌器直径，则可以增加搅拌转速，由此翻动量下降、动压头增大。,(3)挡板,挡板的作用是防止液面中央产生漩涡，促使液体激烈翻动，提高溶解氧。 增加挡板将增加阻力，使得搅拌功率大大增加，

6、混合效果会相应提高。 全挡板条件：指在一定条件下，再增加挡板数量，功率仍保持不变。要满足全挡板条件，须满足下式要求：,(4)通气装置,是从罐的底部向罐内通入无菌空气，一般入口处的压力为0.1-0.2MPa ，罐顶部有空气出口。该设备一般采用空气分布器将无菌空气引入到发酵液中。空气分布器一般用单孔管，开口向下，避免培养液中的固体物料在管口堆积而增加污染的机会。,(5)传热装置,保证发酵过程在恒温条件下进行，将生物氧化和机械搅拌产生的热量及时除去。容积小于5000L的发酵罐一般采用外夹套作为传热装置；容积大于5000L的发酵罐则采用立式蛇管作为传热装置。,(6)机械消沫装置,大量泡沫产生导致发酵液

7、的外溢和染菌机会增大，使得装料系数降低。 消除泡沫的方法是加入消泡剂和使用机械消沫装置。 常用的机械消沫装置为耙式消沫浆。,(7)尾气处理装置,基因工程发酵的尾气必须经过适当处理后才能排放到大气中。 要使尾气无菌，一般采取过滤除菌法。,二、其他类型发酵罐,1、自吸式发酵罐 自吸式发酵罐是一种不需要空气压缩机，而在搅拌过程中自吸入空气的发酵罐。该反应器最关键部件是带有中央吸气口的搅拌器。搅拌器叶轮旋转时，叶片不断排开周围的液体使其背侧形成真空，由导气管吸入罐外空气，吸入的空气与发酵液充分混合后在叶轮末端排出，并立即通过导轮向罐壁分散，经档板折流涌向液面，均匀分布。,1 带轮(带动轴旋转) 2 排

8、气阀 3 消泡器 4 冷却水管 5 电机 6 导气管 7 支架,特点,优点： 不需要空气压缩机。 降低设备成本。 缺点： 进罐空气处于负压状态，杂菌容易侵染。 搅拌转速高有可能切断微生物菌丝影响细胞生长。,2、气升式发酵罐,借助在环流管底部的喷嘴将空气以250-300m/s的高速喷入环流管，使气泡分散在培养基中。由于环流管内部的液体溶有大量气泡，其密度明显小于反应器主体中培养液的密度。借助密度差使培养液作循环式运动，把反应主体中由于菌体代谢而溶氧量低的培养液送入环流管，待培养液补充氧气后再送回反应主体，从而为菌体生长提供良好充足的氧气供应。,内环流式,外环流式,2,3,4,7,1,8,5,6,

9、1 入口 2 空气管 3 上升管 4 冷却夹管 5 压力表 6 罐体 7 气升管 8 排气阀,特点,优点：无搅拌装置，借助培养液的密度差完成液体的循环节能和降低了设备成本。 缺点：不适于黏度大或含有大量固体的培养液中应用。,3、塔式发酵罐,利用通入培养液的无菌空气泡上升来带动液体运动，产生混合效果的非机械搅拌式发酵罐。,H:D=7:1,1 进料口 2 进气口 3 出料口 4 排气口,特点,优点： 结构简单，造价低；减少了剪切对细胞的破坏。 缺点： 罐体较高，需要安装在室外，适用范围较小。,第二节 动物细胞生物反应器,由于动物细胞体外培养具有明显的表达产物的优点，为传统微生物发酵所无法取代，因此

10、，生物技术中许多有价值的生物制品，需要借助于动物细胞培养而获得，这种需求极大地促进了动物细胞培养技术的发展。 大规模的动物细胞培养开始于本世纪50年代，经过多年来的研究，人类对动物细胞培养技术进行了大量的研究开发，取得了很大的进展。,动物细胞培养与微生物培养的不同点,动物细胞无细胞壁，机械强度低，适应环境能力差； 对营养要求严格； 对环境条件敏感； 生长速度缓慢，易受微生物污染，培养时需要抗生素； 大多数哺乳动物需附着在固体或半固体的表面生长；,动植物细胞培养与微生物培养性能的相比,动物细胞培养方法,非贴壁依赖性细胞的培养：来源于血液、淋巴组织的细胞，许多肿瘤细胞（包括杂交瘤细胞）和某些转化细

11、胞属于这一类型，其可采用类似微生物培养的方法进行悬浮培养。 贴壁依赖性细胞的培养：大多数动物细胞，包括非淋巴组织的细胞和许多异倍体体系的细胞属于这一类型，它们需要附着于适量正电荷的固体或半固体的表面上生长。,一、气升式细胞培养生物反应器,气体混合物从底部的喷射管进入反应器的中央导流管使得中央导流管侧的液体密度低于外部区域从而形成循环。气升式生物反应器主要采用内循环式，但也有采用外循环式。,优点,与搅拌式生长反应器相比，气升式生物反应器产生的湍流温和而均匀，剪切力相当小，反应器内没有机械运动部件，因而细胞损伤率比较低；同时由于采用直接喷射空气供氧，氧传递速率高；液体循环量大，能使细胞和营养成分均

12、匀地分布于培养基中。,培养工艺采用阶段式系统。 在气升式生物反应器中，溶氧的控制可以通过自动调节进入空气的速率来实现；pH值可通过在进气中加入二氧化碳或加入氢氧化钠来控制。,气升式反应器和传统培养方法的抗体产率比较,二、中空纤维管生物反应器,中空纤维管生物反应器既可培养悬浮生长的细胞，又可培养贴壁依赖性细胞，细胞的密度最高可达109/ml数量级。如果控制系统不受污染，能长期运转。,纤维管的空腔组成的内室：灌流含氧气的培养基 纤维管之间的空间组成的外室：细胞生长。 细胞接种于外室，贴附在纤维外壁，吸收从内室渗透出来的营养成分，生长繁殖。 细胞分泌的产物和血清中的成分由于分子量较大而无法进入内室，

13、产物只能在外室积累和浓缩。 细胞代谢的废物是小分子物质，可渗透进入内室，从内腔开口排出，避免了对细胞的毒性。,中空纤维反应器是模仿了生物体内毛细血管系统，应用广泛，已进入工业生产，主要用于培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体。,优缺点,优点：占地小，产量和质量高，成本低。 不足：不能重复使用，不耐高压灭菌，只能用环氧乙烷等消毒剂灭菌，不能取样检测。,三、通气搅拌生物反应器,其结构与微生物发酵罐相似。主要区别：较低的高径比，满足细胞对溶解氧的需求；低搅拌转速，大幅倾斜度桨叶或无桨，避免机械伤害；圆形罐底，防止细胞及载体沿体壁的沉积。,四、流化床生物反应器,细胞固定在多孔微载体中，培养基以适当的流速自下而

14、上经过，使多孔载体处于悬浮的流态的反应器。 上部微载体依靠沉降作用与培养基分离，一部分培养基被收集，提取产物，同时排出部分废物；其余部分再流加等体积新培养基，提供营养，实现高密度培养。 这种反应器结构比较简单，传质性能好，采用膜气体交换器，能快速提供氧气。,培养液通过反应器垂直向上循环流动不断提供给细胞必要的营养成分，同时，不断地加入新鲜的培养液，并不断地排除培养产物或代谢产物。 流化床生物反应器既可用于贴壁依赖性细胞的培养，又可用于非贴壁依赖性细胞的培养。,气体交换,氧气,回流,收获,营养液,泵,反应塔,加热器,PH,传感器,T,DO,CO2,五、细胞培养的操作方式,1、分批式操作 已用于搅

15、拌式反应器或气升式反应器培养杂交瘤细胞，生产单克隆抗体。分批培养杂交瘤和骨髓瘤细胞的周期为35天，细胞密度达25105 /ml，最大比生长速率大约为0.05 h-1。单克隆抗体的产量约10100 mg/L。在大规模搅拌反应器中，细胞密度较低，最终达5106，而在7501500 cm2的转瓶生产中，细胞密度达12108。,2、流加式操作,最常见的流加物质是葡萄糖、谷氨酰胺等能源和碳源物质。通过流加控制，可实现高密度培养。 杂交瘤细胞培养，细胞密度可达1.4107，生产抗体的产量比分批操作提高几10倍，可达500 mg/L。 由于培养体积不断变化，流加对过程的控制能力仍然有限在实际生产中应用少。,

16、3、半连续式操作,动物细胞培养生产药物中经常采用。已应用于大规模生产乙肝表面抗原、tPA等基因工程产物。 微载体系统培养基因工程CHO细胞，待细胞长满载体后，反复收获细胞的分泌产物乙肝表面抗原，制备乙肝疫苗。 该方式操作简单，使细胞密度和产量维持在较高水平，能在较长时间内进行持续生产，反复收获产物，生产效率高，是动物细胞培养生产药物中经常被采用的方式。,4、连续式操作,不断收获产物，生产中用于非贴壁依赖性细胞培养。 连续操作的培养条件稳定，抗体处于最佳生产状态，抗体的生产可维持几个星期甚至几个月。可准确控制最优化参数，产率较高，但必须控制培养基的流加速度和液位高度。,5、灌流式操作,细胞被截留

17、在反应器内的连续操作，是最受推崇的用动物细胞生产药物的方式。 用新鲜的培养液进行连续灌注，通过调节灌注速度，可以把培养过程维持废代谢产物处于抑制水平状态以下。 流化床包埋培养人鼠杂交瘤细胞，整个反应器有效浓度达4108/ml，单位体积产量提高200300倍。,液位控制,细 胞 悬 液,细 胞,新鲜培养基,收液,过滤器,细胞培养系统,优点,大大提高了细胞生长密度和产物浓度。 利用培养基，降低细胞代谢废物，细胞生长良好。 产物为分泌蛋白质，滞留时间短，避免了产物的聚合、降解等产量和活性形式的变化，有利于纯化。 中空纤维生物反应器、固定床或流化床反应器、膜生物反应器等操作方式。 缺点：要求复杂仪器设

18、备控制灌流操作过程。,不同培养方式对CHO细胞生产人组织血纤维溶酶原激活剂（tPA)产量和活性的影响。,第三节 植物细胞生物反应器,植物中含有数量极为可观的次代谢物质。据保守的估计，目前已发现的植物天然代谢物已超过2万种，而且还在以每年新发现1600种的速度递增。李时珍的本草纲目中所开列的1892种药物绝大多数是植物。目前仍约25%的法定药品来自植物。,植物生长缦慢，即使是大规模人工栽培仍然不能从根本上满足人类对经济植物日益增长的需求。 许多有价值的植物只能生长在某一特定的地理区域，且受到很多自然条件的限制和影响，尤其是有些植物从种植到收获要花几年时间，很难满足需要。 植物细胞培养是指在离体条件下将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中，将组织振荡分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖来获得大量细胞群体的方法。,植物细胞培养历史,1902年，德国植物学家G.Haberlandt就预言植物细胞培养的可能性。 1937年前后，法国和美国科学家分别成功的进行了胡萝卜和烟草的组织培养。 1966年Klein指出，能利用植物细胞培养物代替收集或栽培植株来生产生化制品。 近40年来，植物细胞培养研究成功的例子已有不少，如用紫草悬浮培养物生产紫草宁；烟草细胞的大量培养等等。,与微生物相比，植物细胞具有的特性,细胞大，细胞壁以纤维素为主要