rt-qPCR实验操作.ppt

1、荧光实时定量PCR rt-qPCR,定义 实时荧光定量PCR(rt-qPCR)： 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化对PCR过程进行 实时监控，以此实现对初始模板的定量分析。,a,3,Rt-qPCR的应用,mRNA表达的研究 微小残留病变的检测 肿瘤耐药基因表达的研究 病毒感染的定量监测,a,4,PCR基本原理,试管中进行的DNA复制反应，依据 1.DNA半保留复制的机理 2.体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性质 通过人为控制体外合成系统的温度，使 1.双链DNA变成单链 2.单链DNA与人工合成的引物退火 3.DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。,a,5,

2、基本步骤 变性：加热使双链DNA变为单链（94，30s） 退火：降温使引物和互补模板在局部形成杂交链 （55，30s） 延伸：耐热DNA聚合酶按53方向催化以引物为起始点的延伸反应（7072，3060s）,a,6,示意图,a,7,Real-time定量PCR仪是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测和连续地分析整个PCR进程，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线，最后通过标准曲线对未知模板进行定量的分析。,a,8,SYBR Green,SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位，只有和双链DNA结合后才发出荧光，DNA双链分开就不发出荧光，随P

3、CR循环数的增加，产物量的增多，产生的荧光信号逐渐增强，实现了荧光信号与产物量的关联。,a,9,理论上来说，PCR反应过程中生成的DNA产物是呈指数方式增加的，即每增加一个循环，PCR产物加倍。但随着反应循环数的增加，产物积累、原料消耗，最终PCR反应无法继续维持指数方式的扩增，而进入线性期和平台期。整个PCR反应过程中，只有在指数期，PCR产物的量与加入的初始模板量存在明确的数学关系（PCR产物量=初始模板量2N，N=循环数），因此，利用公式，可以由产物的量精确推算出初始模板量的多少。而在线性期和平台期，PCR产物量和初始模板量之间不存在准确的数学关系，由这两个时期的产物量来推算初始模板量的

4、多少是不准确的。,a,10,在相同的条件下，进行复制扩增，每扩增一个循环，通过检验荧光来检测每个孔里目标基因片段的含量，记录每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数（样本的域值循环数Ct），次数越多就说明目标基因在原本的样品里越少，即初始模板的量越少。,a,11,logX= n (1+E)+logX0,a,12,实验步骤,1、把要测的RNA逆转录为cDNA，决定要跑的基因和使用的内参序列，排好板的顺序。 2、准备好DNA样本，水，sybr，前后引物，融化，离心。 3、计算样本混合物（每个孔加sybr10ul、cDNA30ug、水8.4ul-cDNA），前后引物的量（每个孔加前后引物

5、各0.8ul），多算1到2孔。按比例混合样本，sybr，水。按比例混合前后引物。 4、按照排板的顺序往板内加样本混合物，每孔18.4微升，加完后按排板顺序加相应的前后引物混合物，每孔1.6微升。 5、贴膜，离心，上机，Real Time PCR扩增结束后输出对照组和待测组的目的基因及内参基因的CT值。,a,13,即实验组基因表达相较于对照组上调或下调的倍数。,a,14,荧光定量PCR如何减小误差,1、校准生物学误差：内参(管家基因) 2、降低随机误差,a,15,1、校准生物学误差内参(管家基因),内参基因(Endogenous Control) 用于校准实验过程中样品本身对定量结果的影响 原因：核酸提取时通常以重量，体积或细胞数为单位取 样，提取过程中存在得率差异和操作误差，造成 等量样品不一定获得等量提取物 目的：将定量结果校准为以基因组（或单个细胞）为 单位，不同样品之间才具有可比性