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文档简介
1、荧光实时定量PCR rt-qPCR,定义 实时荧光定量PCR(rt-qPCR): 在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的变化对PCR过程进行 实时监控,以此实现对初始模板的定量分析。,a,3,Rt-qPCR的应用,mRNA表达的研究 微小残留病变的检测 肿瘤耐药基因表达的研究 病毒感染的定量监测,a,4,PCR基本原理,试管中进行的DNA复制反应,依据 1.DNA半保留复制的机理 2.体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性质 通过人为控制体外合成系统的温度,使 1.双链DNA变成单链 2.单链DNA与人工合成的引物退火 3.DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。,a,5,
2、基本步骤 变性:加热使双链DNA变为单链(94,30s) 退火:降温使引物和互补模板在局部形成杂交链 (55,30s) 延伸:耐热DNA聚合酶按53方向催化以引物为起始点的延伸反应(7072,3060s),a,6,示意图,a,7,Real-time定量PCR仪是在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测和连续地分析整个PCR进程,随着反应时间的进行,监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线,最后通过标准曲线对未知模板进行定量的分析。,a,8,SYBR Green,SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位,只有和双链DNA结合后才发出荧光,DNA双链分开就不发出荧光,随P
3、CR循环数的增加,产物量的增多,产生的荧光信号逐渐增强,实现了荧光信号与产物量的关联。,a,9,理论上来说,PCR反应过程中生成的DNA产物是呈指数方式增加的,即每增加一个循环,PCR产物加倍。但随着反应循环数的增加,产物积累、原料消耗,最终PCR反应无法继续维持指数方式的扩增,而进入线性期和平台期。整个PCR反应过程中,只有在指数期,PCR产物的量与加入的初始模板量存在明确的数学关系(PCR产物量=初始模板量2N,N=循环数),因此,利用公式,可以由产物的量精确推算出初始模板量的多少。而在线性期和平台期,PCR产物量和初始模板量之间不存在准确的数学关系,由这两个时期的产物量来推算初始模板量的
4、多少是不准确的。,a,10,在相同的条件下,进行复制扩增,每扩增一个循环,通过检验荧光来检测每个孔里目标基因片段的含量,记录每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数(样本的域值循环数Ct),次数越多就说明目标基因在原本的样品里越少,即初始模板的量越少。,a,11,logX= n (1+E)+logX0,a,12,实验步骤,1、把要测的RNA逆转录为cDNA,决定要跑的基因和使用的内参序列,排好板的顺序。 2、准备好DNA样本,水,sybr,前后引物,融化,离心。 3、计算样本混合物(每个孔加sybr10ul、cDNA30ug、水8.4ul-cDNA),前后引物的量(每个孔加前后引物
5、各0.8ul),多算1到2孔。按比例混合样本,sybr,水。按比例混合前后引物。 4、按照排板的顺序往板内加样本混合物,每孔18.4微升,加完后按排板顺序加相应的前后引物混合物,每孔1.6微升。 5、贴膜,离心,上机,Real Time PCR扩增结束后输出对照组和待测组的目的基因及内参基因的CT值。,a,13,即实验组基因表达相较于对照组上调或下调的倍数。,a,14,荧光定量PCR如何减小误差,1、校准生物学误差:内参(管家基因) 2、降低随机误差,a,15,1、校准生物学误差内参(管家基因),内参基因(Endogenous Control) 用于校准实验过程中样品本身对定量结果的影响 原因:核酸提取时通常以重量,体积或细胞数为单位取 样,提取过程中存在得率差异和操作误差,造成 等量样品不一定获得等量提取物 目的:将定量结果校准为以基因组(或单个细胞)为 单位,不同样品之间才具有可比性
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