高效液相色谱法(HPLC)测定饮料中山梨酸和苯甲酸

1、卫生化学实验七高效液相色谱法（HPLC）测定饮料中山梨酸和苯甲酸一、 实验目的与要求1、 掌握高效液相色谱法测定饮料中苯甲酸和山梨酸的原理和方法 2、 了解高效液相色谱仪的基本结构和使用方法 3、 熟悉饮料样品的处理方法 2、 实验方法与原理苯甲酸和山梨酸广泛用于食品防腐剂，能够引起人的再生障碍性贫血，粒状白细胞缺乏等。因此国家严格限制其使用量。在本实验中，样品首先经过超声和加热除去二氧化碳和乙醇，然后过滤注入高效液相色谱仪，经反相C18液相色谱柱分离后，紫外检测器230 nm波长处检测。以色谱峰的保留时间定性，色谱峰面积在一定范围内与浓度呈线性关系进行定量分析。 3、 实验仪器与试剂1、 仪

2、器：高效液相色谱仪（Waters，美国）：2487紫外检测器、1525高压输液 系统、717进样系统、Waters Breeze色谱工作站；超声震荡仪；100 ml烧杯（1个）； 1 ml和100 l移液枪；离心管若干个；离心管架；微孔滤膜（0.22 m）。 2、 试剂 ：（1） 甲醇（色谱纯）；醋酸铵溶液（0.02 mol/L，色谱纯）；流动相分别超声脱气（10 min） （2） 山梨酸储备溶液(1.0 mg/ml）：准确称取0.2500 g山梨酸，加超纯水定容至250 ml。 （3） 苯甲酸储备液（1.0 mg/ml）：准确称取0.2500 g苯甲酸，加超纯水定容至250 ml。 4、 实

3、验步骤1、 样品处理 碳酸饮料（雪碧）：吸取10 ml碳酸溶液超声5 min，然后用微孔滤膜（0.22 m）过滤，滤液备用。吸取100 l滤液于离心管中，并加入900 l超纯水，混合均匀标记为样品。 2、 配制标准溶液 （1） 取一定量的苯甲酸储备液，经滤膜过滤于离心管中。吸取滤液50 l于另一离心管并加入950 l超纯水，得到50 g/ml的苯甲酸标准品，做好标记。 （2） 同理得到50 g/ml的山梨酸标准品，做好标记。 （3） 混合标准品配制：分别吸取500 l过滤后的苯甲酸和山梨酸储备液于离心管中混合均匀，得到500 g/ml的混合标准品。吸取50 l混合标准品（500 g/ml）于离

4、心管中并加入950 l超纯水，得到25 g/ml的混合样，标记为混标。 3、 色谱条件： 色谱柱：C18反相键合色谱柱 流动相：甲醇-0.02 mol/L醋酸铵溶液（5 : 95） 流速：1 ml/min 检测波长：230 nm 进样量10 l 4、 标准品和样品测定 （1） 分别进苯甲酸（50 g/ml）、山梨酸（50 g/ml）标准品，确定保留时间。 （2） 记录混合标准品（25 g/ml）的峰面积并按下式计算样品中苯甲酸和山梨酸含量： 计算方法：Cx=FCsAxAs式中：Cx为样品中被测物的含量（g/ml）；Cs为苯甲酸或山梨酸标准品的含量（g/ml）。F为稀释倍数；Ax样品的峰面积；A

5、s标准品的峰面积。 5、 实验数据记录及结果计算1、苯甲酸、山梨酸标准品的保留时间物质 苯甲酸山梨酸保留时间（min） 6.780 9.1522、混合标准品及样品的峰面积 物质 苯甲酸 山梨酸 样品苯甲酸 山梨酸 峰面积（mAU*min） 386576 2067181 234426 31073、 实验结果计算根据公式：Cx=FCsAxAs计算得：C苯甲酸=1025234426386576 =151.6g/mlC山梨酸=102531072067181 =0.375g/ml雪碧中含有151.6g/ml的苯甲酸，0.375g/ml的山梨酸。六、注意事项1、 如果被测溶液含有气泡，对测定和仪器的使用均有影响，因此需要将被测溶液超声加热除去二氧化碳。 2 、苯甲酸的灵敏波长为230 nm，山梨酸的灵敏波长为254 nm，在此波长测定时苯甲酸的灵敏度较低。因此波长选择230 nm。 3、平衡前用甲醇：水（5:95）冲洗柱子15 min，再用甲醇-0.02 mol/L醋酸铵溶液（5:95）进行平衡。 4、开机顺序：高压输液系统、进样系统、柱温箱、检测器、电脑软件。 5 、使用盐做流动相的时候：水：甲醇=95: 5冲洗柱子20 min以上；然后用甲醇冲洗色谱柱20 min以上，保存色谱柱。