酶的提取与分离纯化.ppt

1、A，1，6章酶法提取和分离纯化，1，酶法提取和分离纯化技术途径，2，细胞分裂，3，酶法提取，4，酶法分离，go，go，go，5，酶法联合分离纯化策略，Go，A，3，酶纯化过程可分为大约三个阶段：(1)粗蛋白：取样均质分解细胞全蛋白质萃取，使用盐析沉淀法；能大概去除蛋白质以外的物质。(2)部分精制：初步精制，使用纵列色谱。(3)均质酶：目标酶的纯化，制备电泳或HPLC可用。酶分离纯化阶段，本章列表，A，4，2节：细胞分裂许多酶存在于细胞内。为了提取这种细胞内的酶，必须先粉碎细胞。(1)机械粉碎2)物理粉碎3)化学粉碎4)酶解，JY92-II D超声波细胞粉碎机，细胞粉碎珠，高压细胞粉碎机，DY8

2、9-I电工玻璃匀浆机，A，5，机械粉碎法，粉碎方法均一法，通过各种物理因素的作用破坏组织，细胞的外部结构，粉碎细胞。通过对细胞膜的各种化学试剂的作用粉碎细胞，通过细胞本身的酶或酶制剂的催化作用破坏细胞的外部结构后，细胞分裂、细胞粉碎方法及其原理，本章的清单，A，6，进入珠磨机的细胞悬浮液，与极细的玻璃珠、石英砂、氧化铝等磨料(直径小于1毫米)一起快速搅拌或磨碎。珠子在珠子分离器的帮助下停留在破碎的室内，浆液流出，连续运行。破裂的热量通常导入夹克冷却。1 .维密，原理：A，7，实验室大小的细胞粉碎设备有Mickle高速组织捣碎机，Braun匀质机；中试规模的细胞粉碎可用胶质磨粒处理。在工业规模中

3、，可以使用高速联珠磨(由瑞士WAB公司和德国西门子机械公司制造)。珠子粉碎速度一般控制在80%以下：降低能耗，减少大分子目的物的失活，高粉碎率引起的小细胞碎片分离不容易，在后续工作中遇到困难。A，8，使用高压均质机(由高压泵和均质阀组成，产品在英国APV和美国Microfluidics均销售)。2 .高压均质法3354大规模细胞粉碎利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，突然减压和高速冲击冲击冲击使细胞破碎，细胞悬浮液从高压室针形阀喷出时，超速度达数百米，高速喷出的浆液又射回停止冲击环，在出口管道中改变方向细胞在这一系列高速运动过程中，从剪切、碰撞、高压到大气压力的变化，使细胞分裂。原则：A，9，在工

4、业规模的细胞分裂中，对酵母等脆弱高浓度的细胞，经常使用多周期工作方法。引起堵塞的块菌或丝状真菌、小革兰氏阳性菌、包含体的基因工程菌(身体结实，容易对真菌造成损害)，不应使用高压均质法。在A，10，15-25 kHz频率下操作。其原理可能与空化现象引起的冲击波和剪切作用有关。空化是由于超声波的快速冲击而封闭的，产生了很强的冲击波压力，导致粘性涡流在介质中对悬浮细胞产生剪切应力，使细胞液体流动，使细胞分裂。3 .超声波粉碎法，一般来说，菌比球菌容易破碎，G-细菌比G细菌容易破碎，对酵母的效果不好。这种方法多用于实验室小细胞粉碎。但是通过超声波的化学自由基可以停用一些敏感的活性物质。A、11、A、1

5、2，4。酶溶解法(恩兹亚纯酶)、(1)酶法、常用溶剂、溶菌酶、-1、3-葡聚糖酶、-1、6-葡聚糖酶、蛋白酶、卡鲁拉利用溶酶体系统处理细胞时，应根据细胞壁的结构和化学组成选择适当的酶，并确定其顺序。酶溶解的优点：选择性释放产品，温和条件，少核酸排出，完整的细胞形状。缺点：酶价格高，酶共同性低(不同菌株需要不同的酶)，产品抑制的存在。在酶体系中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖对葡聚糖酶有抑制作用。A，14，活性刺激自身细胞溶解酶，以达到微生物产生过度细胞溶解酶或细胞自行溶解的目的。影响溶解过程的主要因素包括温度、时间、pH值、活化剂、细胞代谢途径等。缺点是，对于不稳定的微生物，容易引起所需蛋白

6、质的变性，自我分解后细胞悬浮液的粘度大，过滤速度小。(2)一些化学试剂，如自溶解法(Autolysis)、A，15、有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的渗透性(渗透性)，使细胞内物质有选择地渗透。4 .化学渗透法，取决于化学试剂的种类和细胞膜的结构和组成。A，16，三色调x-100等非离子洗涤剂对疏水物质有很强的亲和力，结合和溶解磷脂，破坏内膜磷脂双分子层，释放特定细胞内物质。黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠等其他表面活性剂也可以粉碎细胞。(1)表面活性剂溶解细胞的特定成分，其增溶有助于细胞分裂。处理A，17，G-细菌对细胞外膜有损伤作用。G-细菌的外膜结构通常保持

7、在二价阳离子Ca2或Mg2与脂多糖和蛋白质结合的情况下。EDTA螯合Ca2或Mg2时，大量脂多糖分子脱落，在细胞壁外膜形成洞穴。该区域填充了内层的磷脂，提高了内层的渗透性。(2)EDTA螯合剂，A，18，分解细胞壁中的脂质，使细胞壁膨胀，细胞破裂，细胞内物质释放。甲苯、苯、氯仿、二甲苯和高级酒精。(3)有机溶剂，(4)变性剂，盐酸胍(Guanidine hydrochloride)和尿素(Urea)是常用的变性剂。变性剂和水的氢键削弱溶质分子之间的疏水性，使疏水化合物溶解在水溶液中。A，19，恶劣的通用性；时间长，效率低，一般细胞内物质释放率不超过50%。一些化学试剂有毒。化学渗透法的优点：缺

8、点：对产品释放具有一定的选择性，通过小分子量溶质，例如多肽和小分子的酶蛋白，核酸等大分子量物质仍停留在细胞内；细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，便于固液分离和进一步提取。A，20，将浓缩的细菌悬浮液冷却到-25 以形成冰晶，利用500MPa以上的高压冲击将冷冻细胞从高压阀门孔挤出。细胞粉碎是由于冰晶的磨损而使卡在冰中的微生物变形而发生的。该方法主要用于实验室，适应范围大，破碎速度高，细胞碎片破碎程度低，活性保持率高，但不适用于对冻结敏感的生化物质。5 .其他方法，1 .X-press方法，A，21，将细胞放入高渗透介质，如一定浓度的甘油或蔗糖溶液，平衡，然后进入渗透压降的缓冲液或纯净水，由于渗

9、透压的急剧变化，水迅速进入细胞内，引起细胞膨胀或破裂。在细胞壁上只有更脆弱的细胞或细胞壁事先用酶处理，或在培养过程中添加抗生素等特定抑制剂，细胞壁有缺陷，强度减弱。2 .渗透压法(Osmotic pressure)，A，22，低温冷冻细胞，然后在室温下慢慢融化，反复数次。由于冷冻，细胞膜疏水结合结构破裂的同时，细胞内结晶改变细胞内外的溶液浓度，使细胞膨胀破裂。细胞壁适合脆弱的菌体，破碎率低，需要多次重复，在冻融过程中会引起特定的蛋白质变性。3 .重复冻结-融化方法，A，23，导致细胞结合水分损失，从而改变细胞的渗透性。使用丙酮、丁醇或缓冲液等处理干燥细胞，可以轻松提取细胞内的物质。气流干燥主要

10、适用于酵母，一般在25-30 的气流中烘干。真空干燥多用于细菌。4 .干燥法，A，24，3，粉碎率测定及粉碎技术研究方向，细胞粉碎后，带电荷的大量内容物被释放到水相中，传导性增加。1 .粉碎率测量，直接测量方法目的产物测量方法电导率法，使用染色方法将粉碎细胞与未分解细胞区别开来。如果破碎的革兰氏阳性菌可以染成革兰氏阴性杆菌的颜色；用格兰染色法染色酵母粉碎液，完整的细胞为紫色，受损细胞为鲜红色。通过将粉碎的细胞悬浮液与离心分离，测定上清液中蛋白质或酶等目的产物的含量和活性，并与100%粉碎率获得的基准数值进行比较，计算出粉碎率。A，25，细胞分裂与固液分离密切相关。2 .粉碎技术研究方向、多种粉

11、碎方法结合，以及上游工艺和下游工程、化学、酶、机械方法的组合。用溶解酶预处理面包酵母，然后高压均匀化，在95MPa压力下4次均匀，总粉碎率接近100%。高压均质化方法，在相同条件下粉碎率只有32%。在发酵培养过程中，培养基、生长时间、操作参数(如pH、温度、通气量、搅拌速度、稀释率等)对细胞壁膜的结构和组成有一定的影响。细胞的粉碎与上游培养过程有关。通过遗传工程改造提高细胞内物质的提取速度也很重要。繁育后期，加入抑制或阻止细胞壁物质合成的抑制剂，如青霉素、环丝氨酸等，培养一段时间后，新分裂的细胞细胞壁有缺陷，容易破碎。选择革兰阴性细菌等脆弱菌株作为宿主细胞；在细胞内引入噬菌体基因，培养结束后，

12、调节特定条件(如温度等)，激活噬菌体基因，使细胞内向溶解，释放内容物。A，26，定义：酶提取是指在特定条件下，用适当的溶剂或溶液处理含有酶的原料，使酶充分溶解在溶剂或溶液中的过程。也称为酶提取。原则：提取酶时，首先要根据酶的结构和溶解特性选择合适的溶剂。一般而言，极性物质溶于极性溶剂，非极性物质溶于非极性有机溶剂，酸性物质溶于碱性溶剂，碱性物质溶于酸性溶剂。，第三节酶提取，A，27，酶可以溶于水，通常可以提取水或稀酸，稀碱，稀盐溶液等，有些酶与脂质结合，或包含更多非极性组分，则可以提取为有机溶剂。提高温度、降低溶液粘度、增加扩散面积、减少扩散距离、增加浓度差等提高酶分子的扩散速度，有助于提高提

13、取效果。为了提高酶的提取率，防止酶变性火的停用，提取过程中要好好调节温度、pH等提取条件。A，28，提取酶的主要方法，本章中的列表，A，29，大部分蛋白酶溶于水，在低浓度盐存在的条件下，酶的溶解性随着盐浓度的增加而增加，称为盐剂现象。a，30，盐溶液萃取(盐剂salting-in):ionic strength，溶解度，NaCl，NaCl，KCl，分子在等电点相互吸引，收集到沉淀中添加盐离子会破坏这种吸引力，使分子分散，溶于水。A，31，酸溶液萃取，部分酶在酸性条件下溶解度高，稳定性好，易于使用酸溶液萃取。注意：pH值不能过低，以免禁用酶变性。A，32，碱溶液萃取，部分酶在碱性条件下溶解度高，

14、稳定性好，必须用碱溶液萃取。注意：pH值太高，不能停用酶变性。A，33，有机溶液萃取，部分酶与地质物质强烈结合，或含有更多的无极基团，可与水混合溶解的乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂萃取。注意：pH值不能过低，以免禁用酶变性。A，34，影响酶提取的主要因素，温度在适当的范围内，提高温度可以提高酶提取速度；在PH等电点避免；增加提取物的体积可以提高酶的提取率。但是过量的提取物会降低酶的浓度，不利于进一步分离和纯化。A，35，4节酶的分离方法，1，沉淀分离，2，离心分离，3，过滤和膜分离，4，色谱分离，Go，Go，Go，5，电泳分离，Go，Go1.沉淀分离1，定义：沉淀分离是改变特定条件或添加某种物质降

15、低酶的溶解性，从溶液中沉淀，与其他溶质分离的技术过程。A，37，由于浓缩效果大于精制，沉淀方法通常是从去除细菌或细胞碎片的发酵液中沉淀生物物质，然后利用色层分离等进一步提高纯度的初步分离方法。沉淀法由于成本低、产率高(不停用蛋白质等大分子)，浓度倍数高的l0-50倍，操作简单的优点，是下游加工过程中广泛应用的值得注意的方法。A，38，2，沉淀的种类盐析沉淀等电点沉淀有机溶剂沉淀复合沉淀选择性变性沉淀法，A，39，1，盐析沉淀法，(1)定义：利用不同蛋白质在不同盐浓度条件下溶解度不同的特性，在酶溶液中加入一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中沉淀，分离酶和杂质的过程、A，40，(2)原则，1。高浓度盐离子减少蛋白质表面双层厚度，降低静电排斥效果2。中性盐比蛋白质亲水性强，将水分子与蛋白质竞争。A，41，蛋白质表面特性，蛋白质溶解：同类相溶