细胞培养技术【高级课件】

1、细胞培养的基本知识，炭疽，1，精制课件，细胞培养理论的部分内容，1，细胞培养的概念：细胞培养是机械的或酶消化的，从组织中分离细胞，模仿体内环境，在灭菌，适当的温度，ph，营养条件下生长和增殖，维持正常结构和功能的一种培养技术，2，精制课件。 体内细胞：身体的神经体液调节和其他类型的细胞在基因表达被外来信号调节和增殖的过程中持续分化(从一般到特别)，进行高度专业化的结构和功能，体外细胞：体内神经体液调节和其他种类的细胞影响细胞的许多外来信号，在特定分化基因表达减弱或停止的情况下，在进化中保持保守增殖活动的特征(从特别到一般)和体内细胞结构和功能的差异特征：失去原有形态，失去了细胞的功能。 4、培

2、养细胞类型，附着依赖性细胞附着于玻璃、塑料等非活性物质的表面生长、生存和维持。 悬浮培养细胞细胞悬浮在液体培养基上增殖。5，精制课件，5，细胞周期细胞周期：从细胞前分裂终止到此分裂终止的时期过程。G0期：细胞不再沿周期进行，进入休眠状态，G1期，DNA克隆前，主要是RNA合成和蛋白质合成，染色体克隆的准备，s期- DNA克隆期，DNA克隆完成，G2期- DNA克隆后，纺锤丝形成的准备，m期33333组中的大部分细胞在间隔，少数在分裂期。分割时间短。6，精制课件，整个细胞周期可分为G1 S G2 M G1，如下图所示：7，精制课件，细胞生长曲线，体外培养的细胞达到一定密度后，应继承。传代的频率或

3、间隔与培养液的性质、接种细胞数、细胞增殖速度等有关。接种细胞数多，细胞基数多，在相同的增殖速度条件下细胞数增加，饱和速度和相对快。连续细胞系和肿瘤细胞系比第一代培养细胞增殖快，培养液中血清含量多的多细胞增殖越少，增殖越快。细胞增殖代一般可以用8，纯化课件，9，纯化课件，细胞生长曲线： MTT方法测定。用BRDU检测有丝分裂细胞。10，精制课件，BRDU (5-溴2-脱氧尿嘧啶新)的结构与thymidine相似，在DNA合成过程中，可以像thymidine一样混合在细胞DNA中，用BRDU单克隆抗体免疫细胞化学法检测BRDU标记的结果，直接合成DNA的过程，11，精制课件，12，精制课件，细胞凋

4、亡是细胞自身程序的结束，生命的活性死亡过程，特征形态和生化变化，由基因控制的自主秩序，选择性自我消亡过程，这种消除机制是保证生命进化的基础。，13，精制课件，细胞凋亡特性，细胞凋亡过程的性能(细胞收缩致密染色质边缘集核碎片凋亡素)1，特殊表面结构(微绒毛等)和接触区域的丢失，平滑轮廓形成，从周围活细胞分离2，细胞收缩，14，精制课件，3，细胞机完整性保持扫描电镜，细胞表面具有独特的分化细胞形状，线粒体肿胀，内膜不会破裂；短滑移面内质网(SEN)扩张、扩张间隙和细胞表面融合；有时有絮凝体倍数的半结晶核糖体。细胞表面可能有平行的微丝。4、遗忘体形成细胞凋亡细胞在细胞凋亡细胞中分解成多个圆，每个细胞

5、凋亡素有自己的小器官。周围不会引起炎症反应。15，精制课件，5，核内染色质结构变化(最值得注意的变化)染色质团聚体在核膜下出现：核物质固体收缩；边缘集；核浆压缩；核膜褶皱。16，时尚课件，17，时尚课件，Annexin V是检测细胞凋亡的敏感指标之一。与早期细胞凋亡细胞细胞膜结合的磷脂结合蛋白，细胞质膜变化是细胞凋亡时最早的变化之一，细胞凋亡时细胞膜磷脂(PS)在原生质膜内向外翻，Annexin V具有磷脂丝氨酸和高度亲和力，与暴露在细胞外的磷脂酰亚胺林结合。18，纯化课件，细胞培养影响因素，血清：一般用作小牛血清(包括胎牛血清)和其他动物血清。根据研究目的，血清成分妨碍药物或受体及营养研究等

6、研究实验，无血清培养基常用。19，精制课件，pH值：大多数细胞在pH7.4中生长得最好，一般不超过6.8，7.6。渗透压：培养液渗透压一般在260320 mosm/kg之间，20，精制课件，培养液3360目前一般通过商业化基础培养液(如RPMI1640，MEM，DMEM，F12等)对特定细胞培养早期壁不容易粘附的特定细胞培养等培养要求采访后应尽快培养，由于任何原因不能立即培养时，应放在4 的培养液中保存，但时间不能超过24小时。抓组织的时候要严格保持杀菌，也要避免与其他有害物质接触。在采集病理组织、皮肤及消化道上皮细胞时，由于携带容易，为了减少污染，用500 1000单位/ml青、链霉素的PB

7、S溶液冲洗5 10分钟即可。操作传代培养或初级细胞。注意，集中，轻轻移动，22，干练的课件，原代培养：从组织中获得的细胞访问培养瓶或培养盘的过程称为原代培养。初级培养有两种方法：酶消化和组织阻滞法。以水牛成纤维细胞BEF为例，23，精制课件，组织块方法：回到屠宰场-实验室，用75%的酒精喷射整个牛， 切开小脚肌肉- PBS洗两次-将小肌肉切成绿豆颗粒大小- 75%酒精浸泡一分钟- PBS洗三次-将小组织切片均匀地排列在培养瓶底部(组织块和组织块之间必须有空隙) -添加一些培养液(培养液稍微浸泡组织块比较合适)-培养后第二天添加一些培养液比较好- -再加两天-换水添加新的培养液(此时组织块附着在

8、培养瓶底部，培养液最好浸泡组织，复盖培养瓶底部)-直到培养瓶底部充满细胞为止，每2-3天更换一次液体-细胞填满时通常7-8天，细胞能充分生长。，24，精制课件，胰蛋白酶消化屠宰烧糊-回到实验室，用酒精喷洒75%的牛， 切开小脚肌肉PBS洗两次将小肌肉切成绿豆颗粒大小在75%酒精中浸泡1分钟将组织块放入3-20毫升的小瓶中，用剪刀剪下组织将3-4毫升的胰蛋白酶添加剂放入培养箱消化组织中每10分钟用吸管反复吹入组织，有助于细胞分解液体浑浊添加培养液以完成消化- 1500-2000旋转/分离心6分钟-扔掉上清液-添加培养液中形势浦，轻轻粉碎细胞，然后放入细胞培养瓶中培养。 通常5-6天，细胞能充分生

9、长。25，纯化课件，图2-1组织培养5日水牛图2-2酶消化5日水牛胎儿成纤维细胞胎儿成纤维细胞，26，纯化课件，继代培养细胞充满细胞培养瓶底部时及时继承细胞，否则影响细胞生长。每一代都称为“一代”。有限细胞株只能传播到体外数十代，而转基因细胞株或细胞株则无限遗传。在培养瓶中添加0.25%胰蛋白酶，最好直接复盖培养瓶底部用酶消化药5分钟显微镜观察大部分细胞漂浮投入含血清的培养液结束消化转到离心管1500-2000转/分离心6分钟放弃培养液重悬浮细胞将细胞轻轻分食后，细胞培养瓶27、精制的课件，细胞冷冻细胞的保存和复苏是细胞培养的必要阶段。要防止细胞在体外长期培养时丢失，对细胞要及时冷冻保存。但是

10、细胞在活着的情况下开始初级培养，其各种生物学特性逐渐变化，随着传代数量的增加和体外培养条件的变化，出现了新的变化。因此，在适当的时间将低一代细胞冷冻保存在适当的地方是必要的(一般来说，冷冻保存2-3代细胞比较好)。28、在没有精制课件、细胞冻结原理保护的情况下，直接冷冻保存细胞，细胞内及细胞外环境中的水将被结晶，从而引起电解质浓度增加、渗透压变化、脱水等细胞内的一系列变化。将保护剂甘油或二甲基亚砜(DMSO)添加到培养基中，冰点降低，在缓慢的冻结条件下，细胞内的水分在冻结之前泄漏到细胞外。-130 以下低温保存，可以减少冰晶的形成。溶解细胞时速度快，通过最容易通过细胞的-5 0。29，精制课件

11、，冷冻方法1。选择大生长期细胞，在24小时前交换液体。2.用现有胰蛋白酶消化细胞后，以106-107/ml细胞浓度为基准，悬浮在包含10% DMSO的培养液中(此时培养液冷却，DMSO阿伯丁在室温下可以产生毒性)3。用吸管吸出细胞悬浮液，分0.25毫升的细胞冷冻保管管，封好。4.冷冻保存4 半小时- -202小时- 80-通宵-液氮长期保存。30，精制课件，海东线法1。液态氮中除去冷冻保管管，迅速放入37水浴，在一分钟内融化。2.用75%的酒精喷雾细胞冷冻管，用灭菌的纱布擦管用灭菌剪刀剪下2根管子将细胞悬浮移至离心管，补充培养液，1500rpm低速离心6分钟以上(DMSO在常温下对细胞有毒，细

12、胞复苏后，应尽量去除扔掉上等液，添加培养液，培养第二天附着细胞时交换液。解冻方法必须快，31，精制课件，细胞活力1，试管中放入细胞悬浮液0.5ml. 2，0.5ml 0.4%希望染料溶液，染色2 1 3分钟。3、在玻璃片上摄取一些悬浮液，然后添加盖子。4、反射镜，对测定死细胞和活细胞数、细胞活力的几种随机视野。死细胞可以被染成深蓝色，镜上的心兰色细胞没有染色，活细胞呈无色透明的样子，32，干练的课件，33，干练的课件，染色体检查，(1)在4 冰箱里保存一瓶大生器官的细胞，12小时，扔掉旧液体，秋水仙碱的最终浓度为0.4(2)离心和预热后的KCl(0.075m/ml0.075m/ml)放入5ml

13、，37 ，培养35分钟(此步骤用低渗透使细胞膜破裂)。(3)预先固定1毫升新制成的固定液(甲醇：冰醋酸=3: 1)，用离心力收集细胞。(。(4)除去离心力，将5毫升固定液慢慢固定在4冰箱50分钟，用低速离心力收集细胞。(5)扔掉离心力，加入0.7毫升固定物，反复搅拌混合。(6)取20 冷冻幻灯片，从25厘米高(保持一定高度对染色体的分散有利)滴在玻璃灯泡上，快速干燥，用Giemasa(原液：PBS=1:9)染色30分钟，冲洗和干燥。显微镜观察，34，纯化课件，水牛胎儿成纤维细胞染色体，35，纯化课件，免疫细胞染色，免疫荧光细胞化学根据抗原抗体反应的原理，首先用荧光素标记已知抗体，然后用该荧光抗

14、体作为探针，检查细胞或组织内抗原，36，纯化课件，细胞或组织形成的抗原抗体复合体中包含荧光素，并用荧光显微镜标记标本，37，精制课件，荧光抗体，1，异硫氰酸盐荧光(FITC)标记，最大吸收光谱490-495纳米最大发射光谱520-530，黄绿色荧光。2、TMR异硫氰酸四乙酯(ITC)标记最大吸收光谱为550 nm，最大发射光谱为620 nm，橙色荧光，fittc的黄绿色光对比明确，与蛋白质结合方法FITC可用于双标记研究。38、精制课件，细胞免疫荧光染色的基本步骤，1、将灭菌盖幻灯片放在培养皿中，细胞接种培养。2、培养液4%的聚甲醛放入室温，固定15分钟(为了更好地维持细胞和组织的原始形态结构

15、，防止组织的自我溶解，需要固定细胞和组织。固定的作用不仅包括凝固细胞内的蛋白质，终止或抑制外来性及内源酶活性，更重要的是尽量保存细胞和组织的抗原性，将水溶性抗原转化为非水溶性抗原，防止抗原扩散。39，精制课件，3，TBSA清洗，吸收献血0.01%Ttitonx-100，PBS室温效果加1% Ttitonx-100 5min(以进入细胞通透性增强抗体为目的)4，去污剂，40，精制课件，6，添加一定比例的1抗矿工化60分钟(如果需要孵化更长时间，可以考虑在培养基中保持湿润状态，避免干燥，如有必要，在冰箱中通宵孵化)7，0.01%Ttitonx-100TBSA洗几次后，贴上FITC标记的第2段，41，精制课件，8，0.01%Ttitonx-100TBSA三次清洗，(