质谱发展历史-基础知识.ppt

1、a,1,第一章 简介,一.质谱的发展历史 1906年 J.JThomson在实验中发现带电荷离子在电磁场中的运动轨迹与它的质荷比(m/z)有关,并于1912年制造出第一台质谱仪. 1946年 发明飞行时间质量分析器(Time-of-flight Analyzer) 1953-1958年 出现四极杆质量分析器(Quadrupole) 1956年 GC-MS开始联用 1959年 质谱首次用于peptide sequencing 1965年 离子共振质谱出现 1968年 电喷雾离子源Electrospray Ionization 1973年 LC-MS 1974年 Fourier transform

2、 ion cyclotor resonance MS 1987-1988年 Matrise_assisted laser desorption ionization 1996年 电喷雾离子源开始用于生物大分子的研究,a,2,什么是质谱仪?,质谱仪是按照离子的质荷比(m/z)不同,来分离不同分子量的分子.测定分子量进行成分和结构分析. 离子的生成方式有失去或捕获电荷(如:电子发射,质子化或去质子化) 主要组成部分: 1.进样部分 2.离子源 3.质量过滤器(分析器) 4.离子检测器,a,3,离子源,质量过滤/分析器,检测器,进样部分 样品板 LC或GC,EI源 FAB源 MALDI源 ESI源,

3、Quadruopole Ion trap Time-of-flight,电子倍增器 闪烁计数器,第二章 质谱仪的组成,+ + + +,+ + + + + + + + + + + + +,+,+,+,+,+,+,+,+,+,a,4,第一节 进样部分,要求： 大气压下的样品要进入高真空的质谱仪，而不影响仪器的真空度。 方式： 进样板进样 进样头进样 毛细管进样（从气相色谱及液相色谱柱）,a,5,第二节 离子源,A :EI源 Electron Ionization 是1980年以前的主要离子化方式,只能用于远远小于生物有机分子的小分子(400Da以下)的检测,样品需经过汽化(通常热解吸附)进入电离区

4、,与电子流撞击.电子流传递部分能量(多小于6ev)形成离子及部分碎片.,a,6,EI的优缺点,优点 1.级的灵敏度 2.有达10万个化合物的数据库可快速检索 3.可根据碎片方式鉴定未知物 4.从碎片离子判定结构,缺点 1.质量范围小 2.有可能汽化前发生解离 3.碎片过多有时看不到分子离子,a,7,FBI快速原子/离子轰击离子源 Fast Atom/Ion Bombardment,使用高能量的氙原子Cs+离子或甘油-NH4+集团喷射样品靶上的样品和基质表面,基质是溶解样品的非挥发性溶剂,样品从基质中解吸附并汽化,离子化. 基质的作用是溶解样品;吸收大部分能量,有助于样品离子化并保护样品不被高能

5、量撞击破坏.,a,8,a,9,FBI优缺点,优点 1、质量数可以做到7000Da。 2、快速。 3、软电离方式，碎片离子少。 4、容易引入阳离子形成M+Na,M+K型的正离子。 5、分辨率高。基质可作为参照离子进行精确质量测定。 6、大质量的甘油团形成多电荷可测生物大分子。,缺点 1、质量数高时灵敏度下降严重。 2、灵敏度比MALDI,ESI低。 3、碎片少，结构信息少。 4、基质多峰，干扰结果分析。 5、样品必须能溶于基质。 6、非极性物质难以离子化。,a,10,C: MALDI 激光解吸附离子源 Matrix-Assisted laser Desorption/Ionization,MAL

6、DI源的出现解决了生物大分子的离子化难题，离子化过程与FBI有相似之处。 1、使用基质，但基质为固体。 2、 MALDI用脉冲激光束轰击样品和基质的共结晶。 对基质的要求是能吸收337nm紫外光并气化，能量由基质传给样品使样品一起气化并离子化。,a,11,a,12,a,13,常用基质,1、氰基4羟基肉桂酸 CCA 多肽 2、3,5二甲氧基4羟基肉桂酸 SA 蛋白 3、龙胆酸（2,5二羟基苯甲酸 DHB 聚合物 4、吡啶甲酸 PA 5、3羟基吡啶甲酸 3HPA MALDI源由氮激光器产生短周期脉冲激光，产生的多为单电荷离子，效率很高，即使只有极少的样品也可分析,a,14,常用基质结构,DHB,S

7、A,CCA,a,15,MALDI的优缺点,优点 1、质量数可达300,000Da。 2、attomole 至femtomole级灵敏度。 3、软电离方式，无或极少碎片离子。 4、耐盐（样品含盐可达毫摩尔浓度）。 5、适于分析复杂混合物。,缺点 1、分辨率低。 2、1000Da以下基质峰干扰。 3、激光解吸附离子化有可能使样品光降解。 4、串联质谱功能较弱，除非接反射装置进行源后衰变测量。 5、不能分析非共价键相互作用。 6、定量时需要内校准。 7、如没有反射飞行装置，不能分析多肽修饰。 8、对各种赋形剂的容忍度低（如 含磷酸缓冲液，大于150mM的盐等。,16,a,Sample submiss

8、ion In solution, as concentrated as possible, volume 10-20 ul Minimum Concentration 10 pmol/microliter Use 200ul PCR-style eppendorf tubes,The sample should NOT contain any Azide SDS Brij 35 Tris base CHAPS Triton X-100, Treduced Triton X-100 DMSO Tween DMF Zwittergent Glycerol any other detergent P

9、hosphate buffers Salts and buffers 100 mM,The following components are ACCEPTABLE Acetic or formic acid Acetonitrile, ethanol Guanidine/HCl 4M Hexafluoroisopropanol up to 40% Methanol Sodium chloride 10 mM Urea 1M,a,17,D: ESI离子源 Electrospray Ionization,4000v强电场中，样品溶液通过毛细管喷嘴喷出，带电液滴被静电场吸向质谱人口，同时伴随干燥或加

10、热干燥气体吹送，使液滴表面溶剂挥发,液滴体积变小，表面电荷密度变大，当同种电荷之间的库仑斥力达到雷利极限时，突破表面张力，液滴爆裂为更小的带电液滴，这一过程不断重复，使最终的液滴非常细小，呈喷雾状，此时液滴表面电场非常强大，使分析物离子化，带单电荷或多电荷。 一般分析物分子量 2000Da带多电荷,a,18,a,19,NANO-ESI喷雾照片,a,20,ESI特点,1、 ESI产生的生物大分子离子如多肽蛋白等常常带10个以上电荷，使得m/z大大减小，弥补了四极杆质量分析器等质量范围窄的缺点。 2、质谱图显示的是离子带不同电荷数的一系列质荷比峰，根据峰位置换算成质量数和电荷数。,a,21,电荷数

11、和质量数的计算,已知 mj=(m+nj)/nj mk=(m+nk)/nk nj= nk+1 推算出 nj=(mk-1) /(mk- mj) nk=(mj-1) /(mk-mj) m=mjnj-nj =mknk-nk,m/z,相对丰度,mj,mk,a,22,ESI优缺点,优点 1、质量数可达70，000Da 2、灵敏度高达femtomole级。 3、软电离，可观察生物分子非共价反应。 4、易于和LC串联，直接分析流速为1ml/min的LC洗脱液。 5、没有基质干扰。 6、适于联四极杆质量分析器、离子阱质量分析器做结构分析。 7、带多电荷，允许质量范围窄的设备检测高质量数的离子。 8、带多电荷，通

12、过计算平均值给出更精确的质量数。 9、特别适于测多肽的修饰。 10、样品前处理简单可直接分析RP-HPLC脱盐处理的溶液。,缺点 1、耐盐能力低。 2、对某些化合物特别敏感，污染难清洗。 3、样品需先气化，混合物不适用。 4、带多电荷，在分析混合物时，产生混乱。 5、定量时需内校准。,a,23,E: 其他离子化方式,阳离子化: 以非共价键结合的方式向中性分子加上正电荷。 尤其适合质子化不稳定的的分子，质子化是共价键结合，电荷从质子向分子发生转移，这以过程会造成分子的不稳定，使分子裂解。 阳离子化没有这一缺点，常用在ESI离子方式中，糖类非常适合这一电离方式，一般多加Na+. 阴离子化: 分子失

13、去一个质子，带上正电荷，这种离子化方式适合酸性物质，如酚类、羧酸和磺酸。,24,a,第三章 质量分析器（过滤器）,第一节：质量分析器的主要指标 A、质量范围（/） 所能测量的质荷比范围 M+nH B、灵敏度 一定浓度样品产生响应时，最低的浓度值。,n,a,25,D、分辨率 质谱分辨不同质荷比离子的能力 分辨率R=M/ a =M/(M M) b a 公式定义为单峰的质荷比与其半峰宽之比 b公式定义为相邻的相交10的两个峰M M 按a 式计算的分辨率约为b式计算的两倍。,a,26,不同分辨率谱图效果,a,27,E：分子量的表述方式,1、单同位素质量monoisotopic mass 最轻的稳定同位

14、素的质量（也有说自然界中丰度最大的同位素的质量）。 只有高分辨率的质量分析器才能分离出单同位素峰。,a,28,2、化学平均分子量M 根据同位素质量及丰度计算出平均质量，所有元素的平均质量给出分子的平均质量。 3、最高峰质量 即未分辨开质谱峰最高处的质量数。 表述方式要看分子量及分辨率而定，当m/z高时单同位素峰已不是丰度最大的峰， m/z 8000时与最高峰质量趋于一至。,a,29,a,30,第二节 质量分析器的种类,A、四极杆质量分析器Quadrupole Analyzer A、B极性相反，加上一个直流电压DC，叠加一个射频电场RF，扫描时固定RF频率， DC： RF保持比率不变，数值递增，

15、使m/z小到大的离子依次通过，取得一张完整的质谱图。,a,31,DC+RF,a,32,四极杆质量分析器的 优点,四极杆质量分析器通常与EI、ESI源联接 1、能容忍相对低的真空度（约10 x10Torr） 2、m/z可达3000， ESI离子源产生的多电荷生物分子离子m/z正好多在3000以内。 3、开销低廉。,a,33,B、离子阱质量分析器,三维的四极杆，RF加在环形电极上。,环形电极,a,34,离子阱质量分析器,三维的四极杆，RF加在环形电极上。,a,35,C、飞行时间质量分析器 Time-of-Flight Analyzer,离子的E=UZ=mv 飞行时间t=,t=const,L,v,m

16、,z,a,36,反射飞行时间质量分析器(RETOF-MS),Uref,a,37,TOF对真空度的要求非常高10Torr MALDI源一般同时联接Time-of-Flight Analyzer和RETOF,a,38,D、傅立叶回旋共振质量分析器 fourier Transform-Ion Cyclotron Resonance,质量精度最高，达0。001,a,39,几种质量分析器的比较,a,40,第三节：质量分析器的串联,目的：碰撞诱导产生碎片离子，进行结构解析 Collision-induced dissociation(CID) Ion source ion daughter ion gra

17、nddaughter ion,选择离子,MS,CID,MS/MS,CID,MS/MS/MS,a,41,空间串联质谱仪,A、串联四极杆（三级四极杆） triple-Quadrupole Analyzer Q为过滤单元Q为碰撞单元Q为分析单元,a,42,a,43,几种检测方式,1、MS方式： 所有离子通过QQQ到达检测器。 2、MS/MS方式： Q作为分析器选择母离子(前体离子），Q作为碰撞室产生子离子，子离子由Q分析。 3、MS方式：,a,44,三级四极杆的几种扫描模式,1、子离子扫描模式：即MS/MS。 2、前体离子扫描模式： Q依次将所有离子输入Q碰撞解离，Q设定一个特定子离子值，只检测此特

18、定子离子， Q与Q联接，当检测器检测到子离子时，质谱仪记录的是Q中的子离子值，质谱图显示的是所有产生相同子离子的母离子。 3、中性丢失扫描： Q扫描与Q有一特定质量差异的子离子，谱图显示的是所有特定中性分子丢失的母离子。,a,45,B、三级四极杆飞行时间质谱仪 Quadrupole time of flight,a,46,C、飞行时间飞行时间质谱仪 Time-of-flight/time-of-flight,a,47,时间串联质谱仪,A、离子阱质谱仪：,a,48,a,49,B、傅立叶回旋共振质谱仪 Fourier transform-ion cyclotron resonance,离子进入共振

19、腔后，通过调控RF，选择特定的母离子留在腔内，再引入惰性碰撞气体碰撞,产生碎片,并检测碎片离子，这一过程不断重复至MS。,a,50,几种串联质谱优缺点对比,a,51,第四章 检测器,一、电子倍增检测器： 真空度低，表面易污染，寿命一般12年。,a,52,二、光电转换倍增器（闪烁计数器）,电子发射撞击荧光屏，荧光屏发射光子由光子放大器检测。光子放大器密封在容器中，光子可穿过密封玻璃，避免表面污染，寿命为5年。,a,53,三、HED (High-Energy Dynode Detector),在离子倍增器前加一个加速静电场，离子加速 后产生更多的二级电子引发电子雪崩，灵敏度更高。,a,54,四、F

20、T-MS,FT-MS本身就是一个检测器，因为离子诱导产生的可检测电流与m/z有关。,a,55,第五章、质谱在生物学中的应用,一、肽质量指纹谱鉴定蛋白。 二、串联质谱鉴定蛋白技术,a,56,The nomenclature of the common peptide fragment ions developed by Roepstorff and Fohlman,a,57,The proposed mechanism of formation of b and y-type ions,a,58,三、肽序列标签技术,通过测部分氨基酸序列，结合此序列前后的离子质量和肽段母离子质量进行数据库检索，称

21、为肽序列标签技术。,a,59,四、O标记从头测序技术,蛋白酶解时，酶解液中H2 O和H2 O各占50， 酶解后肽段的羧基端上的羟基氧 O/ O丰度比1：1，使Y型离子系列的M+2/M同位素峰的丰度高于正常未标记 O的离子的同位素丰度比。,18,18,16,18,16,18,a,60,五、磷酸化蛋白质的鉴定,A：MA结合磷酸酶水解,磷酸化蛋白,MS,蛋白酶水解,MS,磷酸酶脱HPO3,MS,通过比较几级质谱图，比较质量数少80Da或80倍数的肽段。,a,61,B、串联质谱进行母离子、中性丢失 扫描，分析含HPO3的肽段产生的特征离子，直接从混合肽段中找出磷酸化肽段。,a,62,C、PRD-MAL

22、DI-MS 用源后衰变技术寻找质量数少80Da或98Da的肽段来判断磷酸肽。,a,63,D、用IMAC技术分离/富集磷酸肽对比前后质谱变化寻找磷酸肽。 IMAC immobilized metal affinity固相金属亲和色谱。 IMAC 对磷酸肽有高选择结合能力，富集后用高PH或磷酸盐洗脱后测质谱 。,a,64,E、磷酸化位点的确定,找到磷酸肽后，串联质谱子离子扫描模式对磷酸肽进行序列分析。,a,65,F、磷酸化定量分析,1、N稳定同位素标记法：,N培养基,14,15,N培养基,14,a,66,2、同位素亲和标记法,细胞池1,细胞池2,混合,消除氘,消除氢,亲和纯化,酶解,MS,磷酸肽或

23、磷酸化蛋白在缄性环境下发生消除，同时用亲核试剂攻击形成的双键并发生加成反应，亲核试剂一种为氘原子、一种为氢原子，再接上一个亲和标签（如生物素biotin），混合酶解，提取含biotin的肽段进行MS检测。,a,67,六、糖基化蛋白的鉴定,A、用糖甙内切酶切断糖链与蛋白链间的糖甘键，将反应前后的质谱图比较，可知糖链的平均质量。,a,68,B、糖基化位点的确定,先用蛋白酶酶解成含糖链和不含糖链的肽段，获得其肽质量指纹谱，再用糖苷内切酶切除糖链，其肽质量指纹谱将发生变化，含糖肽段发生丢失位移，通过网上数据库检索其序列，找到位点。,a,69,C、用凝集素直接提取含糖肽段，再结合质谱技术分析,凝集素对含

24、糖肽段有专一亲和性,a,70,七、质谱在蛋白质组学中的应用,A、稳定同位素代谢标记技术。前面已介绍 B、同位素亲和标签技术,ICAT,专一与Cys共价结合,a,71,a,72,优缺点,优点 1、兼容分析任何条件下的体液、细胞、组织中的绝大部分蛋白。 2、烷化反应在盐、去垢剂/稳定剂（如SDS、尿素盐酸胍等）存在下都可进行。 3、只分析含Cys残基的肽段，降低分析复杂性。,缺点 ICAT本身分子量较大（500Da左右）增加数据检索复杂性。 无法分析不含Cys的蛋白。,a,73,Why 2D LC/MS?,可鉴定极端具有pI、疏水性、分子量的蛋白质 适合膜蛋白 重复性好 容易自动化 上样量大 高灵

25、敏度（溶液酶切） 可根据样品灵活配置（但最后一维一般为RP）,a,74,Then why SCX/RP/MS?,SCX和RP的分离原理是互补的 SCX按荷电情况，PR按疏水性 流动相是兼容的 pH3，ACN/water/salt SCX流动相中的盐可以在RP时有效去除 Tryptic peptides 在SCX柱上可以有效保留 Tryptic peptides在SCX条件下是稳定的,a,75,Separation power Peak capacities,2DE 500 - 10,000 protein spots Affinity Chromatography 2 Ion exchange

26、 Chromatography 10 protein level Gelfiltration 10 Reversed Phase Chromatography 50 Ion Exchange Chromatography 25 Reversed Phase Chromatography 100 peptide level 2DLC (IEX/RPC) 2,500 Linear IT MSn 18,000 mph*,*measurements per hour,a,76,(7) Sample Considerations for LC/MS 样品的要求,The Analyte Must Have

27、 Ionizable Groups Amines Carboxylic Acids Ketones, Aldehydes For Best Sensitivity, Work at a pH Where the Analyte is Ionized Neutral to basic pH (7-9) for acids Acidic pH (3-4) for bases,a,77,Sample Considerations for LC/MS,Positive Ion Mode Analyte = (M+H)+ Negative Ion Mode Analyte = (M-H) Basic C

28、ompound Sensitive in Positive Ion Mode Acidic Compound Sensitive in Negative Ion Mode,a,78,Gel,Gel spot,Proteolytic peptides,Mixture of Proteins,Digestion,Proteolytic peptides,Digestion,LC,Protein Identification Workflows,Peak Finding,Peak list,Search of a Sequence Collection,Identified and Proteins

29、,Protein Candidates,Significance Testing,Protein Function?,Sequence Similarity Search,a,79,RPC,IEX,RPC trap,RPC trap,on-line elution by salt plugs to trap column,IEX,off-line gradient elution with “classical” fraction collection,RPC,2D LC的三种配置形式,IEX,RPC,in-line MudPIT,a,80,on-line 2D-LC,优点 全自动 样品体积可

30、根据后续RPC调整 在线脱盐、浓缩 自由选择缓冲盐,缺点 SCX峰容量有限 ACN浓度在IEX和RPC得一致 两相分离都没能在最佳状态下进行,a,81,off-line SCX with fraction collection,优点 两维分离都有可能在最佳状态下进行，得到最好分辨率和峰容量 可自由选择缓冲体系 样品体积可根据后续RPC调整 速度快（只需一个SCX操作） SCX馏份可留待以后分析(ESI和MALDI均可）,缺点 自动化程度低,a,82,The secret behind sensitivity Reducing column dimensions,75 m I.D. column

31、s and 200 nl/min are the standard today,75 m I.D. columns and 200 nl/min are the standard today,a,83,Data dependent MS/MS,基本原则 先做一次全扫描（full MS)，记录个丰度最高的离子 然后依次对这X个离子进行CID, 做MS/MS(full MS2) 然后再做全扫描, 下一个data dependent MS/MS开始 Dynamic exclusion 某个离子在做了一定次数（比如2次）的MS/MS后，将在一定时间内（比如3min）不再作为侯选离子。,a,84,碎片离

32、子的命名,a,85,Residue name (A-Z) monoisotopic mass average mass A 71.03711 71.0788 B 114.53493 114.59625 C 103.00919 103.1388 D 115.02694 115.0886 E 129.04259 129.1155 F 147.06841 147.1766 G 57.02146 57.0520 H 137.05891 137.1412 I 113.08406 113.1595 J 0.0 0.0 K 128.09496 128.1742 L 113.08406 113.1595 M

33、131.04049 131.1925 N 114.04293 114.1039 O 0.0 0.0 P 97.05276 97.1167 Q 128.05858 128.1308 R 156.10111 156.1876 S 87.03203 87.0782 T 101.04768 101.1051 U 150.95364 150.034 V 99.06841 99.1326 W 186.07931 186.2133 X 111.0 111.0 Y 163.06333 163.1760 Z 128.55059 128.62315,氨基酸残基质量,a,86,ESI-MS/MS vs MALDI-

34、MS/MS why LTQ/LCQ type instrument so popular in proteomics?,a,87,a,88,a,89,主要特点 1 能做高通量、复杂体系的蛋白质鉴定，通量约为每小时鉴定100200个蛋白。 2 动态范围宽，能在混有大量高丰度蛋白的体系中，鉴定出痕量的低丰度蛋白。 3如数据库中检索不到结果，可自动进行de novo的测序。 4集成ICAT或其它同位素标记的蛋白定量方法。 5 能测定多种翻译后修饰（如：磷酸化、糖基化等）的个数和位点。 6 能够测定寡核苷酸序列。 7 能够解析蛋白的一些共价和非共价的相互作用。 8能够表征药物、天然产物等的结构，推测其断裂机理，进行药物代谢研究。 9对化合物进行精确定量分析。 10灵敏度高达fmol级，分辨率高，可进行超高分辨扫描。,a,90,a,91,Why nanospray,提高灵敏度,a,92,Protocol for a Keratin-Free Environment,1) Perform as much work as possible in a biological safety cabinet (BSC)or laminar flow hood