流式细胞术原理及应用课件

1、流式细胞术原理及应用，1，PPT学习交流，1，流式细胞术？流式细胞术的结构2，如何设计流式实验？第三，流式实验涉及的关键阶段4，常规流式细胞术应用，2，PPT学习通信，1，流式细胞术的基本概念，流式细胞术是快速直线流中细胞和生物粒子的多参数，快速定量分析和分类技术。研究对象是各种细胞、微生物和合成微球等生物粒子。定性和定量分析生物粒子的物理参数和生物学特性。3，PPT学习交流，4，PPT学习交流，流式细胞术，5，PPT学习交流，流式细胞术5大系统，移动室和流驱动系统激光光源和光束形成系统光学系统信号检测和分析系统细胞分类系统，6，PPT学习交流，移动室和流驱动系统空气加压注射2。驱动泵精密定量

2、注射，7，PPT学习交换，激光光源和光束整形系统，1。氩离子气体激光器，2266um 2。固体激光，405纳米，488纳米，561纳米，635纳米，8，PPT学习交流，光学系统，镜头，过滤器，小孔；LP:long-pass filter sp:short-pass filter BP:band-pass filter，9，PPT学习交流，信号检测和分析系统，物理参数FSC:定向角度光，11，PPT学习交换，阈值：溶液中的杂质或死细胞容易产生小的干扰信号，因此要设定阈值，排除杂质、细胞碎片或大小小的死细胞。FSC反映单元格卷的大小，FCM应用程序经常选择FSC设置阈值。5%，32%，基本阈值，提

3、高阈值12，PPT学习交流，荧光信号细胞自发荧光特定荧光信号荧光信号荧光信号的线性测量和对数测量-光电倍增管1)检测光子，转换为电信号2)电信号的比例放大荧光信号的面积、宽度和高度，13，PPT一般FSC和SSC变动范围较小，因此使用线性放大。荧光信号变异范围大，使用对数放大。线性测量：DNA含量、RNA含量、总蛋白质含量对数测量：细胞膜表面抗原检测、14、PPT学习交换、直方图(Distribution Histogram)横坐标：路数坐标：细胞数、散布图(Distribution Histogram) 16，PPT学习交流，17，PPT学习交流，2，fluoresin，荧光概念：这里的波长

4、Excitation wavelength，发射波长(荧光波长)emission wavelength fluorescein Annexin V-FITC；与结合的分子探针；将荧光染料/荧光化合物PI、7-AAD等插入核酸链；CFSE与蛋白质共享结合；荧光蛋白-自体发光，例如GFP、RFP、yvp、CFP、mCherry、DsRed等。19，PPT学习交换，一般是fluorescein，20，PPT学习交换，常用荧光染料，PI(碘化丙基535，623)可以选择性地插入核酸双螺旋碱基对中。常用于DNA分析，要用RNase去除RNA对DNA荧光定量的影响；PI不能通过活细胞膜，通常用于识别死细胞

5、。7-AAD(7-氨基放线菌D 545，647)以插入方式与DNA链中的G-C碱基对结合，通常用于通过活细胞膜识别死去的细胞。DAPI(4，4，6- dim氨基二苯吲哚358，456)可以通过DNA链的A-T基对特异性和非嵌入方式结合。变异系数明显小于其他染料，是理想的DNA定量染料。Hoechst(343，450)通常是Hoechst33342和Hoechst33258，未嵌入的方式与DNA链的A-T基本对相结合。可以染色活细胞，可用于精子分离等活细胞DNA的定量分析；也用于侧群细胞分类。PY(帕佐宁560 560，573) RNA染料可进入活细胞。acridine orange 509，5

6、25(AO)DNA、RNA染料、染色后，DNA呈黄绿色荧光，RNA呈橙色荧光，可以进行DNA/RNA双参数分析。21，PPT学习交流，3，流动实验设计方法，要实验的marker选择合适的florescein标记的抗体，选择合适的同种对照抗体，细胞处理(全血，培养的细胞)染色(室温，20min)离心清洗(全血裂开)各频道之间的路西法可以随意搭配。FACSCalibur通常使用四色配方：FITC、PE、PerCP、APC。1)荧光物质的选择：23，PPT学习交流，b，根据表位合理分布荧光物质，路西法的强度：染色指数stain index，stain index=d/w，CD4，24，PPS选择另一

7、个激光激发路西法，如所示。c，光谱重叠小染料选择，26，PPT学习交流，d，使用耦合染料进行假阳性，0 hour，2 hours，22.5 hours，PE，cd3 PE-cy5，CD8 PE-ccy5设置空白对照(未染色的细胞)，以区分自发荧光和特定荧光，从而避免假阳性结果。28、PPT学习交流，在流动结果中，荧光强弱相对值，光电倍增管电压越大，电子信号越强；电压越小，信号越弱。调节电压，声音控制管的荧光强度为阴性，实验组的荧光值均为相对对照组。001，001，002，29，PPT学习交换，同种抗体：实验染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型(Fc段相同，F(ab)2段不同的染色单克隆抗

8、体：同类免疫球蛋白和亚型相同的剂量和浓度但不免疫动物血清使用存储时间长的路西法抗体时。阳性对照组设定方法：检测抗原为确实表达的细胞；连接其他路西法的有效抗体已经被证明。31、PPT学习交换，荧光补偿是什么？路西法发射光谱重叠修正为什么补偿调节？520、400、500、600、700、575、665、fittc、PE、pc5、laser、单染色管的阴性组和阳性组是所需调节通道的荧光Median值相同时最合适的补偿。un compensated、compensated、fl1-fittc stain、fl2-no stain、fl1-fittc stain、PE-Mme例如：双重染色实验，38，P

9、PT学习交流，门和数据分析，门(Gate，缩写g)是流式细胞术中的重要术语，FCM数据分析过程实际上是选择门和设置门的过程。39，PPT学习交流，流动结果，十字门，线性门，40，PPT学习交流，细胞功能细胞表面，细胞质，细胞核中特定抗原细胞活性细胞内细胞因子活性细胞内钙离子，流式细胞术检测范围，41，PPT学习42、利用：进行PPT学习交流、研究应用、免疫学研究，研究免疫细胞类型抗原特异性t细胞研究细胞因子分泌细胞研究细胞凋亡研究细胞增殖检测干细胞向免疫细胞的分化研究荧光蛋白细胞株转染研究稀有细胞检测。即可从workspace页面中移除物件。即可从workspace页面中移除物件。在神经生物学

10、研究中的应用：神经干细胞和神经前体细胞的特性研究；不同种类神经细胞的鉴定和功能研究；星形细胞和胶质细胞的鉴定和功能；细胞活性、细胞凋亡和细胞周期检测；神经细胞发育过程中干细胞向神经细胞分化的研究。即可从workspace页面中移除物件。即可从workspace页面中移除物件。43，PPT学习交换，在肿瘤研究中的应用：检测细胞凋亡；细胞周期分析；细胞增殖研究；荧光蛋白分析；肿瘤干细胞的鉴定和功能分析；循环肿瘤细胞的鉴定和功能分析；实体肿瘤细胞的检测和分析(肿瘤组织分解为单个细胞后)；肿瘤细胞系的表型分析；细胞活性检测；即可从workspace页面中移除物件。即可从workspace页面中移除物件

11、。即可从workspace页面中移除物件。在细胞生物学和分子生物学研究中的应用：细胞转染效率检测；传递效率检测；分析细胞中荧光蛋白的表达。蛋白质-蛋白质间的相互作用(FRET)分析细胞活性、细胞凋亡和细胞周期；研究细胞分化过程。研究细胞增殖。即可从workspace页面中移除物件。即可从workspace页面中移除物件。即可从workspace页面中移除物件。44、PPT学习交流、高吞吐量检测及在新药开发中的应用：细胞功能变化研究；细胞周期和活性；细胞凋亡；细胞增殖；新药研发；徽章的研究和开发；即可从workspace页面中移除物件。即可从workspace页面中移除物件。即可从workspa

12、ce页面中移除物件。海洋生物学富集和分析细菌、藻类、浮游植物等微生物学细菌和酵母的检测。荧光蛋白检测。生物燃料Bodipy和/或Nile Red中脂质定量藻、蓝藻、酵母和细菌等生物的富集，45，PPT学习交换，4.1细胞周期测试，不同细胞周期的细胞DNA含量差异，G0/G1细胞包含二倍体数量的DNA，G2/M细胞包含4DNA荧光染料可以与DNA结合，DNA含量与荧光染料的含量成正比，荧光强度反映DNA吸收荧光分子的程度。细胞内DNA含量通过流动检查反映，区分细胞周期G0/G1、s和G2/M的比例。第四，一般流式细胞术，46，PPT学习交流，细胞周期分析核酸染料细胞膜非通透性染料：碘化丙基(PI

13、)，溴化乙丁(EB)，不能进入完整细胞膜，必须通过标记固定等提高细胞膜通透性。细胞膜通透性染料：Hoechst、DPAI等是对活细胞染色的DNA，但需要紫外线激光刺激。检测细胞周期需要乙醇固定，增加细胞膜的通透性。需要RNase来消除对DNA的RNA干扰。47，PPT学习交换，检测细胞周期的PI方法一般步骤：单细胞悬浮液(1 106个)，慢慢添加70%的乙醇，在4 固定过夜或在-20 长期固定。离心收集细胞，将乙醇完全冲洗为1ml PBS50ug/ml PI，包含100u g/ml rnasa，0.2% Triton X-100，在37c下染色30分钟后机器检测。48、PPT学习通信、细胞周期检查结果、流式传输可确认G0/G1、s和G2/M单位的比例。增殖指数(pro-root指数，pi):表示s期和G2/M期细胞总数和整个细胞的比例，反映细胞的增殖能力。CV值(变异系数):测量设备测量解析度和准确度的指标。脾细胞，培养肿瘤细胞，49，PPT学习交流，DNA配体检测，病变肿瘤细胞经常发生结构和染色体异常，DNA内容的流动检测可以反映配体情况。DNA指数(DNA index，DI): (G0/G1峰值平均荧光通道数)/(正常二倍体细胞G0/G1峰值平均荧