扫描电镜样品制备课件

1、扫描显微镜（SEM）样品的制备,1,PPT学习交流,一、对样品处理的要求 1.研究样品表面要处理干净 2.研究样品必须彻底干燥 3.非导体样品的导电处理 4.保护样品研究面 5.要求标记物要有形态 二、样品制备关键步骤 取样、清洗、固定 脱水 干燥 粘样 样品导电处理,2,PPT学习交流,一、对样品处理的要求 研究样品表面要处理干净 扫描电镜主要是观察样品表 面形貌和结构，而研究材料表面附 有附着物，它们将掩盖表面微细结 构，最终会影响扫描电镜图像的质 量和分析、解释并且影响图像美观。 2.研究样品必须彻底干燥 扫描电镜需在真空条件下正常工作，含水量高的样品会在真空的镜筒中造成影响。因此样品必

2、须经过干燥处理，而且要彻底干燥。在干燥处理的操作中要尽量减少样品表面形貌的变形，但虽然干燥方法从原始的自然干燥、烘干干燥、冷冻干燥、真空干燥到今天的临界点干燥不断进化。但仍存在变形。临界点干燥被视为最理想的干燥方法，但仍存在约5%的变形。,附着物,蜜蜂触角,蚜小蜂并胸腹节,3,PPT学习交流,3.非导体样品的导电处理 由于电子束在样品表面作光栅状扫描，如果样品导电性能不好，会在样品上聚集电荷放电，有时会损伤样品，直至烧毁。一般生物样品不导电，因此必须对样品做导电处理，即喷镀一层金属膜，一般膜厚为1020nm。并根据样品表面凹凸粗糙状况及样品性质而变化。有的样品需先喷碳再喷金。 4.保护样品研究

3、面 扫描电镜的主要功能是做表面形貌观察或断面结构观察，所以保护样品表面或断面的细微结构是一个十分重要的问题。在清洗、固定、脱水、干燥、粘台等各个处理环节都不能触及或挤压乃至损伤其观察面。 5.要求标记物要有形态 用扫描电镜进行细胞化学研 究时，要求标记物应具有一定 的形态，以便让扫描电镜可以 识别。,4,PPT学习交流,取样,切片,漂白,乙醇离心清洗,冰醋酸浸泡,水浴,熏蒸固定,冷冻,割断,扫描电镜观察,清洗,清洗,镀膜,脱水,清洗,后固定,前固定,粘样,干燥,脱蜡,导电处理,切片,包埋,粘台,晾干或烘干,线路10,线路1,线路2,线路3,线路6,线路7,线路8,线路9,线路5,线路4,二、样

4、品制备程序图,5,PPT学习交流,1.取样、清洗、固定 取样 因研究目的不同，对取样很难做一般的叙述和统一的要求，但 应注意：注意研究目的对样品具有针对性，避免盲目取样；注意 研究目的的典型性，即所取样品应该要有研究的具体对象。 粗样清洗 清洗时针对研究目的和样品性质以及污染物的性质选用不同的 清洗液和清洗方法。 清洗液： 常用的有蒸馏水、生理盐水、各种缓冲液等。 特殊的有蛋白分解酶、氯仿、二甲苯、加酶缓冲液等。 样品固定 （1）固定的目的及要求 采用化学或物理方法 ，快速而准确地（不失真）把研究样品的结 构（包括内部结构）或表面形貌依原样（如生活时的状态)保存下 来，这就是固定。,6,PPT

5、学习交流,（2）固定剂 醛类：戊二醛、甲醛 四氧化锇 （3）固定方法 单固定：戊二醛单固定 、锇酸熏蒸固定 戊二醛锇酸双固定 戊二醛锇酸微波固定 甲醛固定 注意：固定温度04，若样品较大可为510 。 固定时间不尽相同，一般戊二醛固定时间稍长些，锇酸固定时间不宜过长。 固定液浸没样品。,戊二醛单固定（绞股蓝上下表皮）,1%锇酸熏蒸固定（真菌菌丝）,7,PPT学习交流,2、脱水 （1）目的：用脱水剂取代样品中的游离水，以便进行干燥处理。 （2）脱水剂：乙醇、丙酮、叔丁醇、乙腈、六甲基二硅烷胺、正丁醇等。 （3）脱水原理：用一种低表面张力的有机溶剂代换组织细胞中的游离水，使样品在干燥时表面张力减少

6、。 （4）对脱水的要求：不能引起结构变形；脱水要彻底。 （5）脱水方法： 酒精脱水：将固定好的样品用0.1mol/l磷酸缓冲溶液或蒸馏水清洗三次，每次510min。将样品依次置于系列浓度30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的酒精中脱水置换，时间一般为每级1015min。 叔丁醇脱水:将固定好的样品用0.1mol/l磷酸缓冲溶液或蒸馏水清洗三次，每次510min。用系列浓度50%、70%、80%、90%、95%、100%的叔丁醇中脱水，再一次100%置换，每级大约1015min。,8,PPT学习交流,3、干燥 （1）干燥要求：首先无变形干燥，以保证样品干燥后体积和结构都不变形

7、，其次是必须干燥彻底。 （2）干燥方法：临界点干燥法、自然干燥法、冷冻干燥法、叔丁醇干燥法、六甲基二硅胺烷干燥法、乙腈干燥法、烘干干燥法、氮气干燥法、微波干燥法。,不同干燥法扫描电镜图像（蚜虫前胸背板）分别为临界点干燥法、自然干燥法、微波干燥法、氮气干燥法叔丁醇干燥法、乙腈干燥法,烘干干燥法（淀粉粒）,9,PPT学习交流,4、粘样 （1）目的： 保证样品在样品台上不移动，不掉落，尤其是作倾斜、旋转观察使不掉落。 用导电胶粘样，能增加样品和样品台之间的导电性，使样品上聚集的二次电子能通过导电胶传输到样品台上，而不发生电荷积累。 （2）粘贴样品的材料： 粘贴动植物组织块样品最好使用导电胶，常用的有

8、银河粉、石墨粉等导电胶，对于要镀金观察的样品，通常用双面胶粘样；果壳、种子等较大的样品可采用普通胶水粘样，注意等胶水自然干燥后装样。 （3）注意事项： 粘贴样品需注意观察面朝上，并尽可能在水平面的同一高度上，操作时要注意防尘、防潮和防止易飞散样品的相互混杂。,10,PPT学习交流,5、样品的导电处理 （1）金属镀膜法：真空蒸汽喷镀、 离子溅射喷镀： 原理：产生离子束的独立装置被称为离子枪，它提供一定的束流强度、一定能量的Ar离子流。离子束以一定的入射角度轰击靶材并溅射出其表层的原子，后者沉积到衬底表面即形成薄膜。在靶材不导电的情况下，需要在离子枪外或是在靶材的表面附近，用直接对离子束提供电子的方法，中和离子束所携带的电荷。 （2