临床PCR检验的室内质控方法

1、临床聚合酶链反应检测室内质控方法卫生部临床检测中心李，存在问题，概念不清，操作方法不明确，无法编写室内质控标准操作规程，无法选择室内质控材料，无法分析室内质控结果，责任人不明确。对照物质的来源和浓度不清楚或不完整，阴性对照物质的来源通常没有解释。有些是自制的，但制备方法不规范，没有任何质量检查，定量结果不可追溯。所选择的质量控制方法不明确。前20项测试的室内质量控制没有解决方案。没有明确的标准来判断失控，但有些关于失控的模糊声明。一般来说，没有负面失控的判断方法。失去控制后没有分析和处理措施。内部质量控制的概念，IQC)，实验室工作人员采取一定的方法和步骤来持续评估实验室工作的可靠性，旨在监控

2、和控制实验室工作的精度，提高实验室日常工作中批内和批间样品检验的一致性，并确定测量结果是否可靠以及是否可以出具报告。可概括为：(1)执行者：实验室技术员；(2)目的：监测实验室测定的重复性；(3)功能：决定当前批次计量的有效性以及是否可以出具报告。这是对实验室测量的直接评估。IQC室内质量控制的基本内容主要包括三个方面：(1)测量前的质量控制；(2)统计质量控制；(3)质量控制评价。测定前的质量控制、实验室设施、仪器设备的培训和管理理想试剂和操作方法、实验室设施、仪器设备的设计和管理、实验室环境条件的控制：温度和湿度控制设备、稳定或不间断电源、理想的聚合酶链反应实验室设计A、理想的聚合酶链反应

3、实验室设计B、临床聚合酶链反应实验室设计的一般原则，各区独立注意风向，便于因地制宜地开展工作。“16字配方”、传输窗口、传输窗口和临床聚合酶链反应实验室质量管理的特点，“无基因”概念实验室应具有严格的人员进入限制和程序，以使用合格的试剂和消耗品、聚合酶链反应实验室中“污染”的主要来源，以及从临床标本中待测微生物的研究中获得的大量质粒。对特定微生物的克隆以前进行过分析和研究，大量残留的特定微生物污染了以前在实验环境中扩增的产物。这也是导致聚合酶链反应实验室假阳性的“污染”。聚合酶链反应实验室的重要防污染措施，实验室的严格划分和严格遵守工作程序化学方法：实验台面可用10%次氯酸钠(漂白剂)清洗；当

4、某些物品，如放置扩增反应管的平板，必须从污染区转移到清洁区时，应放入2% 10%的次氯酸钠溶液中过夜，彻底清洗后再转移回来。紫外线照射：实验台面、仪器设备、实验室空间UNG、仪器设备及管理、聚合酶链反应仪器、离心机、加样器、恒温设备等应建立技术档案。并应定期维护；应定期校准聚合酶链反应仪器、样品加样器和恒温设备，应使用理想的试剂：进行质量检查、核酸提取或样品处理方法的抗干扰能力(是否能有效去除聚合酶链反应抑制剂)、检测限(定性测量)、测量的准确性，以及线性范围内的批内变化和批间变化的批间试剂的一致性是否污染其他：外包装、试剂完整性、有效期、说明等。理想的操作方法，按照编写可操作的操作规程，进行

5、人员培训，培训范围涉及：仪器设备的使用、维护和校准；试剂和方法的原理；质量管理体系；相关法律法规，东北、统计质控方法、质控物质浓度的选择、质控物质每次(批)量和放置规则的测定、Levey-Jennings质控图法、“即时法”质控方法、“假阳性”统计质控方法、质控物质浓度的选择、定量测定：线性范围内高、中、低浓度的测定定性测定：浓度阴性质控物质接近方法测定的下限， 每次(批次)确定质量控制物质的数量和位置时，如果样品数量少于30个，一个用于弱阳性，一个用于阴性质量控制，质量控制物质的数量按比例增加并均匀分散在临床标本中。 临床样本的处理顺序(核酸提取)可以在标准或校准品之后和临床样本之前进行排序

6、。但是，扩增仪中的位置不应永久固定在一个孔中，而应在每次扩增试验中相应推迟，以便在一定时间内尽可能多地监控每个孔的扩增效果。阴性质控样品的类型、阴性原始血清样品实验过程中带入的空试管、仅含有扩增反应混合物的试管、阴性原始血清样品的功能、监测实验室中先前扩增产物的“污染”以及实验操作引起的样品间的交叉污染。具体而言，例如强阳性样品气溶胶通过取样器造成的污染、强阳性样品通过操作者的手造成的污染、以及扩增反应试剂造成的污染，例如在用翻转离心管提取核酸的过程中在较高温度下培养期间盖子塌陷。核酸提取过程中引入的空试管，在核酸提取过程中监测实验室“污染”的存在(在整个实验过程中，在核酸提取的操作台面区域放

7、置开口，最后以水为底物进行扩增)，试管仅包含扩增反应混合物，监测试剂“污染”，质量控制规则的表达和定义，质量控制规则的表达和功能，常用质量控制规则的符号和定义， 质量控制规则的表达式通常由符号al表示，其中a是在质量控制确定中超过质量控制极限的测量值的数量，l是控制极限，通常由平均值或1 3sd的平均值表示。 当质量控制的测量值超过控制极限l时，该批测量可被判断为失控。常用的13S质量控制规则，其中1在原始公式中为a，3S在原始公式中为l，表示3s。它的确切含义是，如果质量控制的一个测量值超过平均3s范围，则该批测量可被判断为失控。简言之，质量控制规则的功能是用来判断批次是否失控或受控。质量控

8、制规则的常用符号和定义，符号编号定义12S，质量控制测量值超过2S控制限值。13S，一个质量控制测量值超过3S控制限值。22S连续两次质量控制测量同时超过2S或-2s控制极限。在同一批R4S测定中，两种不同浓度质控品的测量值之差超过了4S的质控限值。41S，四次连续质量控制测量同时超过1S或-1s控制限值。7T连续七次质量控制测量显示出上升或下降趋势。10X 10个连续质量控制测量值同时位于平均值()的同一侧。勒维-詹宁斯质量控制图，也称为休哈特质量控制图，由休哈特于1924年在美国首次提出，用于工业产品的质量控制。20世纪50年代初，利维-詹宁斯将其引入临床检验的质量控制。由亨利和西格洛夫改

9、进，这是常用的利维-詹宁斯质量控制图。质量控制图和利维-詹宁斯质量控制图的基本统计意义。在稳定条件下，20个IQC结果中不超过一个应超过2SD(95.5%置信限)；超过3SD的结果不超过3个(99.7%置信度l“假阳性”统计室内质控方法、直接概率计算方法(非正态分布)基于日常检验的阳性率、半Levey-Jennings质控图和质控规则，当阴性质控样本为阳性时，不管阳性率如何，它都处于失控状态，因此所有阳性样本都应重新测定，并加倍阴性质控样本。如果阴性质控样品为阴性，且某项测定的阳性率超过3SD，则该样品不受控制，这是1 3S规则。该结果的阴性结果可根据阳性质控样品发出。所有阳性样本结果不能全部

10、送出，因此有必要找出阳性率增加的原因，并用双阴性质控样本重新检验。几个可能的失控表现，曲线向上漂移：表示污染，这可能是由于某一天操作错误导致的样本泄漏、产品泄漏、试剂污染等实验室污染的上升趋势变化：可能存在累积的产品污染，实验室扩增产物逐渐累积，从而逐渐增加患者结果的阳性率。此时，实验室需要彻底清洁。根据统计规律，概率小于5%的事件称为小概率事件，即发生的可能性很小。当一个小概率事件发生时，可能会有错误，所以有必要分析原因。计算每日患者结果中阳性率的概率。如果这种结果的概率小于5%，就可以判断为失控。根据二项式分布的概率，实验室中一个测试项目的阳性率为p，计算出n个血样中k个阳性结果的概率。根

11、据二项式分布的概率，公式如下：P(X=k)=n！/k！(n-k)！pk(1-p)n-k (1)，其中n是在该实验中测试的样品数，k是正数，p是阳性率。P (x=k) 5%失控。此时，阴性标本可以发出报告，并且在找出原因后，所有阳性标本都将被重新制作。根据二项式分布的概率计算，如果一个实验室检测到HBV DNA，一般患者结果的阳性率为10%，即p=0.1，并且在某一时间25个样本中有6个阳性结果和19个阴性结果，那么在检测过程中污染的可能性可以通过以下方法计算。即，计算25个样本中6个或更多个阳性结果的概率，此时，概率是1-(获得0或1或2或3或4或多于5个阳性结果的概率)，即1-P(0)P(1

12、)P(2)P(3)P(4)=1-(1-0.1)25 25(1-0.1)25。210.14 53130(1-0.1)200.15=0.0334，在本实验室一次从25个样品中获得6个或更多阳性结果的概率为3.34%，小于5%，这是一个小概率事件，即发生的概率很小，可能存在污染导致的假阳性结果。根据泊松分布的概率计算，在血液筛查试验中，许多实验室或检测项目如丙型肝炎病毒核酸、结核分枝杆菌和淋病奈瑟菌的阳性结果率较低。此时，虽然公式(1)可用于计算概率，但如果样本量很大，使用泊松分布来估计二项式分布是一种更简单的方法。根据泊松分布，概率可以用以下公式计算：P(X=k)=(np)ke-np/k！(2)

13、p (x=k) 5%失控。此时，阴性标本可以发出报告，并且在找出原因后，所有阳性标本都将被重新制作。根据泊松分布的概率，如果一个实验室中每个检测结果的阳性率约为2%，则计算出100个样本中8个阳性结果的概率。根据泊松分布，概率可由公式(2)计算，其中n=100，p=0.02，k=8，np=2被代入由公式(2)计算的P(X=10)=28e-2/8！=0.0009 .如果所有的阳性结果都是连续的，样本之间可能存在交叉污染，即阳性样本污染其相邻的阴性样本，这种情况的概率计算公式如下：P=(n-r 1)/n！/r！(n-r)！ (3)其中n是在当前实验中检测到的样本数量，r是连续阳性样本的数量。当连续

14、阳性试样的概率大于计算的概率时，则为阴性标本的结果可以发出，阳性标本之间的交叉污染应予以考虑。样本之间交叉污染的概率的计算，例如，在一次100个样本的HBV DNA试验中，所有两个阳性结果连续出现的概率是：P=(100-2 1)/100！/2！(100-2)！=99/4950=0.02概率为2.0%。因此，在100个样本中，如果两个连续样本三次为阳性，即概率为3.0%，则它是失控的。当一次检测到100个样本时，所有三个阳性结果连续出现的概率为：P=(100-3 1)/100！/3！(100-3)！=98/161700=0.0006概率为0.06%。因此，如果，例如，在100个样本中，三个连续的

15、出现是正的一次，也就是说，概率是1.0%，它是失控的。在室内质量控制的评价中，IQC是一项集体活动，它不仅判断了实验室测量的有效性，也反映了实验室测量趋势的变化。IQC的失控不能作为惩罚的依据，我们应该建设性地找出失控的原因，并采取措施加以改善。应该定期对IQC进行评估。阳性质控样品失控、核酸提取随机错误的常见原因。例如核酸提取中的损失、有机溶剂的不完全去除、样品中扩增抑制剂的残留以及诸如离心管中的聚合酶链反应抑制剂的消耗品。仪器有问题。例如，放大器的阱之间的温度不均匀性以及阱中的温度与所示温度之间的不一致性等。试剂的问题。例如Taq酶和/或逆转录酶的失活、探针的纯度和标记效率以及核酸提取试剂的效率。避免假阴性的措施、纯化核酸样品的重复测定、稀释样品的内部质控(ic)、阴性质控样品常见的失控原因、“扩增产物的污染”、临床样品核酸提取过程中样品间的交叉“污染”、避免聚合酶链反应检测假阳性结果的措施，在严格的实验室划分中，“阴性”质控是通过使用带有“过滤元件”的吸头(与样品