金黄色葡萄球菌检验讲义.ppt

1、本资料来源,金黄色葡萄球菌检验,概况,葡萄球菌属微球菌科，本菌有19个菌种，从人体上可检出12个种。 葡萄球菌属主要与皮肤腺体和温血动物的粘膜相关系，有些种是人及动物的条件致病菌。 金黄色葡萄球菌对人类有致病性，通常被称为病原性球菌。金黄色葡萄球菌可引起化脓性炎症，又称为化脓性球菌。,金黄色葡萄球菌的生物学特性,形态与染色： 金黄色葡萄球菌的典型形态呈球形，直径0.41.2m，大小不一，平均直径约为0.8m。 革兰氏染色阳性，呈葡萄串状排列。无鞭毛、无芽胞。在陈旧培养物中，衰老的菌体常转为革兰氏阴性。,培养特性： 易培养，对营养要求不高，在普通培养基中生长良好。 需氧或兼性厌氧。 最适生长温度

2、37，最适生长pH 7.4。耐盐性强，在含1015%的氯化钠培养基中仍能生长，可用于筛选菌种。 在普通营养琼脂平板上培养1824，可形成圆形、表面光滑、不透明的菌落。可产生金黄色色素，色素为脂溶性，不溶于水，故色素只局限于菌落内，不渗至培养中。,在血平板上可形成明显透明的溶血环。为型溶血。 可产生卵磷脂，在卵黄高盐培养基上形成周围有白色沉淀环的菌落。 大多数菌株分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红试验、 VP试验多为阳性，不产生靛基质。触酶阳性。,金黄色葡萄球菌的酶,金黄色葡萄球菌可产生血浆凝固酶和耐热DNA酶。这两种酶均与金黄色葡萄球菌的致病性有关。 血浆凝固酶：与金黄色葡萄球菌的致

3、病力密切相关。一般认为，血浆凝固阳性的金黄色葡萄球菌菌株有致病力。否则为无力的菌株。血浆凝固酶对热稳定，能抵抗6030min甚至10030min后，仍能保存大部分活性。 耐热DNA酶作为除血浆凝固酶外鉴定金黄色葡萄球菌致病力的指标之一。该酶的最适pH为9.0。,金黄色葡萄球菌肠毒素：是金黄色葡萄球菌一种重要的致病物质。本菌引起的食物中毒是因为食品污染了金黄葡萄球菌后，由细菌产生大量肠毒素而导致的。 近年报导表明，50%以上的金黄色葡萄球菌菌株在实验室条件下可产生肠毒素，并且1个菌株能产生两种或两种以上的肠毒素。 肠毒素是一种可溶性蛋白质，由单个无分枝的肽链组成。分子量约为3000左右。易溶于水

4、，难溶于有机溶剂。,金黄色葡萄球菌的肠毒素,耐热，经100煮沸30min不被破坏，也不受胰蛋白酶的影响。食物中的肠毒素耐热性更强，一般烹调温度不能将其破坏。218248 的油中需30min才能被破坏。可引起急性胃肠炎。 根据肠毒素的血清型，可分A、B、C（C1、C2）、D、E 5 个型。A型肠毒素引起的食物中毒较多，约占50%左右。其他依次为D、C、B和E型。也有AD、AB、AC、BC等。,A型肠毒素毒力较强，摄入1g即可引起中毒；B型毒力较弱摄入25g，才引起中毒。一般认为引起人中毒的最小剂量是1.07.2g/kg。,金黄色葡萄球菌的检测程序,检样25g(mL) 225mL生理盐水或磷酸盐缓

5、冲液,7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤,361,Baird-Parker平板，血平板,涂片染色,观察溶血,血浆凝固酶试验,报告,血平板1824h， Baird-Parker平板1824h或4548h。,BHI肉汤和营养琼脂小斜面,361,1824h,增菌培养基,7.5%氯化钠肉汤：为葡萄球菌选择性增菌培养基，因金黄色葡萄球有耐受高盐的特性，因而能在此增菌液中生长，除某些嗜高盐的海洋菌外，大多数细菌都被增菌液中的高盐所抑制。 胰酪胨大豆肉汤：含氯化钠达10%，以胰酪胨替代牛肉浸粉，并加入少量磷酸氢二钾和葡萄糖促进葡萄球菌的生长。,样品的稀释,固体和半固体样品：称取25g样品至盛有2

6、25 mL磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min10000 r/min均质1min2min，或放入盛有225 mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min2min，制成1:10的样品匀液。 液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品至盛有225mL磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。,增菌与分离培养,增菌培养：吸取5mL上述样品匀液，接种于50mL 7.5%氯化钠肉汤或10%胰酪胨大豆肉汤培养基内，361培养18h24h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在10%胰酪胨大豆肉

7、汤内呈混浊生长。 将上述培养物，分别划线接种到Baird-Parker平板和血平板，血平板361培养18h24h。Baird-Parker平板361培养18h24h或45h48h。,分离培养基,Baird-Parker琼脂：培养基中含有卵黄亚碲酸钾，能抑制大多数细菌的繁殖，并能促进金黄色葡萄球菌的生长使其产生黑色和晕圈。培养基中的丙酮酸钠和甘氨酸也能促进金黄色葡萄球菌的生长。 金黄色葡萄球菌的菌落形态：圆形、光滑凸起、湿润，直径约23mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度，偶而可见无混浊带和透明圈的非典型菌落。 长期保存的冷冻

8、或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。,分离培养基,血琼脂：是一种基础培养基，含有5%的脱纤维血(羊血或兔血)。用于观察金黄色葡萄球菌的溶血现象。金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上呈溶血。 金黄色葡萄球菌的菌落形态：呈金黄色，有时也呈白色，大而突起，圆形、不透明、表面光滑，周围有透明的溶血环。,革兰氏染色,血浆凝固酶试验,试验原理：致病性的金黄色葡萄球菌产生的血浆凝固酶，使血浆中纤维蛋白原转变为纤蛋白，附着于细菌表面 ，产生凝固。 金黄色葡萄球菌可产生两种凝固酶：一种是与细胞壁结合的凝固酶，为结合凝固酶；另一种是菌细胞释放于培养基中，为游离凝固酶。二者的抗原性不同。,血浆凝固酶试验,挑取BairdParker平板或血平板上可疑菌落1个或以上，分别接种到5mL BHI和营养琼脂小斜面，361培养18 h24 h。 取新鲜配置兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入可疑菌落的BHI培养物0.2mL0.3mL，振荡摇匀，置361温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，判定为阳性结果。,