叶绿体色素的提取

1、叶绿体色素的提取、分离、理化性质和含量测定 提取与分离实验日期：2011.10.22 实验者：XXX 同组姓名：XXX 一、 实验目的：1. 学习应用薄层色谱法分离叶绿体色素的实验方法。2. 了解叶绿素的组成、性质和测定叶绿素有助于理解光合作用的本质。二、 实验原理:叶绿体是进行光合作用的细胞器。叶绿体中的叶绿素a，叶绿素b，胡萝卜素和叶黄素与类囊体膜结合成为色素蛋白复合体。这些色素都不溶于水而溶于有机溶剂，故可用乙醇等有机溶剂提取。提取液可用薄层色谱法加以分离和鉴别。 植物活性成分的分离常用薄层层析法和柱层析法，其中柱层析适用于大量制备。本实验采用薄层层析色谱法，其中固定相用硅胶预制板。三、

2、 实验材料与试剂:1. 新鲜的菠菜叶片。2. 体积分数为95%的乙醇，碳酸钙粉末，展开剂。3. 研钵，漏斗，滤纸，三角瓶，剪刀，点样毛细管，层析缸，硅胶预制板。四、 实验步骤:（一） 色素提取液的制备1. 取新鲜叶片45片，洗净，擦干叶表面，去除中脉剪碎（越碎越好），放入研钵中。2. 向研钵中加入少量CaCO3，加23ml体积分数为95%的乙醇，研磨至糊状，再加1015ml体积分数为95%的乙醇，上清液用漏斗过滤出，残渣再用10ml体积分数为95%的乙醇冲洗一次，一同过滤于三角瓶中，即制成叶绿体色素提取液。提取液应尽量避光保存。因提取量较大，可用于其他相关实验（即用于后面的理化性质的验证）。（

3、二） 叶绿体色素的分离1. 取硅胶预制板一个，用点样毛细管吸取上述提取液，平行于硅胶板的短边，距下边缘1cm处用毛细管划线，自然风干后划第二次，重复操作34次，确保划的滤液细线颜色足够深，使分离结果更加明显。2. 取已经加入适量展开剂的层析缸，把硅胶预制板带有色素的一端放入，使其下端浸入展开剂中，但注意液面不可超出滤液细线。迅速改好层析缸盖减少展开剂的挥发对人体产生的不良影响。注意观察展开剂的扩散过程，当各种色素得到较好分离，且展开剂前沿接近硅胶预制板上端边缘处时，取出硅胶预制板迅速用铅笔标出展开剂前沿和各色素带的位置。注意要迅速，否则展开剂前沿很快会挥发消失，且前沿和各个色素带的位置均会有微

4、小变动。3. 测量出前沿和各个色素带距离原点的距离并记录。五、 实验结果与分析（以图辅助以文字展示）:. 自上而下分别为：胡萝卜素，叶绿素a，叶绿素b，叶黄素。各自到原点的距离：展开剂前沿：8.50cm胡萝卜素：8.10cm ，Rf=0.95叶绿素a：6.70cm ，Rf=0.79叶绿素b：6.30cm ，Rf=0.74叶黄素：5.90cm ，Rf=0.69事实上实验中不止看到了这四种色素带，在它们下面还有一些分离出来的色素带，但是不在本实验的讨论范围中，故不予考虑。 理化性质一、 实验目的：验证叶绿体素的理化性质。二、 实验原理：1. 叶绿素可与碱起皂化反应产生的盐能溶于水中，因此可用此法分

5、离叶绿素和类胡萝卜素。2. 叶绿素吸收光子而转变成激发态，激发态的叶绿素分子很不稳定，当它变回基态时可发射出红光量子因而产生荧光。3. 叶绿素的化学性质很不稳定，易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离后，而类胡萝卜素则较稳定。4. 叶绿素中的镁可以被H+取代而成褐色的去镁叶绿素。去镁叶绿素遇铜成为铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易被破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。三、 实验材料与试剂：1. 新鲜菠菜叶片。2. 叶绿素提取与分离实验中剩余的叶绿素提取液。3. 小试管，试管架，水浴锅（60和90各一个），10ml移液管，洗耳球，三角瓶。4. 体积分数为95%的乙醇，笨，醋酸铜

6、粉末，质量分数为5%的稀盐酸，醋酸-醋酸铜溶液，氢氧化钾-甲醇溶液。四、 实验步骤：（一） 光对叶绿素的破坏作用取2支小试管，各加入2.5ml叶绿体色素乙醇提取液，并用乙醇稀释一倍。其中一支放在直射阳光下，另一只用锡纸包严，40min后对比观察颜色有何变化。（二） 皂化作用（绿色素与黄色素的分离）1 取1支小试管加入3ml浓的叶绿素乙醇提取液，加入1ml氢氧化钾-甲醇溶液，充分摇匀。2 片刻后，加入3ml苯，摇匀，再沿试管壁慢慢加入1ml左右蒸馏水，轻轻混匀（勿激烈摇荡），然后置于试管架上静置分层。若溶液不分层，则用滴管吸取蒸馏水，沿管壁滴加，边滴加边摇动，直到溶液开始分层时静置。（三） H+

7、和Cu2+对叶绿素分子中Mg2+的取代作用1 取2支试管，第一支加叶绿体色素提取液5ml，作为对照。第二支试管加叶绿体色素提取液5ml后，再加入质量分数为5%的稀盐酸数滴，摇匀，观察溶液颜色变化情况。当溶液变褐后，再加入少量醋酸铜粉末，60水浴加热，观察溶液颜色变化情况，并与对照试管相比较。2 取新鲜菠菜叶片两小片（能塞进小试管即可），放入试管中，加醋酸-醋酸铜溶液，使之没过叶片，90水浴加热，随时观察叶片颜色的变化，直至颜色不再变化为止。（四） 荧光现象的观察实验前取一支小试管加入3ml浓的叶绿体色素乙醇提取液，在直射光下照射，比较溶液的透射光与反射光颜色有何不同。五、 实验结果与分析（以图辅助以文字展示）：（一） 光对叶绿素的破坏作用利用另外一支试管取未用锡箔纸包的叶绿素溶液进行对比如图，右边为光照后的叶绿素溶液实验前（左边光照）实验后（由于实验过程中包锡箔纸的试管不慎