植物种质的超低温保存

1、第十章,植物种质的超低温保存,种质资源是物种进化和植物育种工作的基础，也是人类赖以生存的基本条件之一。由于自然环境变化和人为因素的影响，天然资源屡遭破坏，其中一些珍稀植物已经消失或濒临灭绝，天然资源受到严重威胁。因此，收集和保护种质资源是全世界都必须重视的紧迫工作。,概要,是指利用天然或人工创造的适宜环境保存种质资源，使个体中完整性，有高的活力，能通过繁殖将其遗传特性传递下去。,种质保存 （germplasm conservation）,目前常用的种质保存方法有以下几类：,（1）种子保存 特点：传统的种质资源保存的主要方式 种子保存占用空间少，保存期较长 易干燥、包装和运输 因此种子在低温下长

2、期保存是防止良种衰变的一条重要途径。 但是，随着储藏时间的延长，种子生活力逐渐下降，而且易受病虫鼠害侵袭。 此外，这种方法对于无性繁殖的种类等不适用。,（2）种植保存 特点：占地多，管理费用高， 需要投入较多的人力、物力 容易受自然灾害等影响 因此已经不适应目前种质资源保存的需要和土地资源紧缺的现状。 （3）离体保存 特点：占用空间少，无病虫害和病毒侵袭 在必要时可迅速大量增殖植物 无病毒，便于国际交流 但是，在正常条件下的植物细胞和组织的培养过程中，不断的继代培养会引起染色体和基因型的变异，可能导致培养细胞的全能性消失，失去形态发生的潜能；另一方面，一些具有特殊性状的细胞株系，也有可能在继代

3、培养中丢失这些宝贵的性状，而且不太经济。,10.1抑制外植体生长的离体保存方法 10.2离体植物材料的超低温冰冻保存技术,10.1 抑制外植体生长的离体保存方法用于抑制生长的外植体可以是茎段，茎尖和愈伤组织等。常用的抑制生长的方法有以下几种：,10.1.1降低温度 10.1.2降低环境中的含氧量 10.1.3使用生长延缓剂 10.1.4其他方法,降低温度是抑制生长最常用的方法。 a.种质外植体在非冻结的低温下，老化速度减慢，因而可使继代间隔时间延长。 例如：通过每年转换一次新鲜培养基，在9下把葡萄小植株保存15年之久，而在正常条件下，需13个月转移一次。b.若某个品种当前需求量不大，但以后有推

4、广的可能性，就可以把它们的培养物置于冰箱里，可以节省连续培养或重新培养所需的时间和经费等。c.降低温度是减缓植物组织细胞生长最简单有效的方法,10.1.1降低温度,10.1.2降低环境中的含氧量降低环境中的氧含量可以达到抑制生长的目的。a.低气压处理是通过降低培养物环境的大气压而使所气体的分压都有降低。b.低氧分压处理是在正常气压下，加进氮气等惰性气体，使其中的氧分压降到较低水平。c.用矿物油覆盖，也使供给培养物的氧气含量降低，延缓生长。,10.1.3使用生长延缓剂在培养基中添加生长延缓剂能有效减缓材料的生长。a.不同抑制剂对不同植物材料的作用效果有所差异b.同一种抑制剂应用在不同植物中，要达

5、到抑制作用而不对植物造成伤害所需要的浓度也有所不同。c.在一种植物上有效地抑制剂在另一种植物上则可能无效。实验已经证明，利用多效唑可以使玉米、水稻、小麦和马铃薯等的试管苗生长素率降低，同时移栽成活率提高。利用二甲基氨基琥珀酰胺酸（b9）、矮壮素（ccc）可以使葡萄试管苗的转管从3个月一次变为一年一次。如果将低温保存与一些生长抑制剂配合使用，则效果更佳。,10.1.4其他方法a.通过降低基本培养集中的培养成分或从培养基中减去一两种营养元素，可使培养物生长受到限制。b.在培养基中添加一些高渗物质，如蔗糖、甘露醇等，造成一定的水分逆境也可减弱代谢活动，延缓细胞生长。c.高渗配合低温也有良好效果，可以

6、显著延长种质保存时间,10.2离体植物材料的超低温冰冻保存技术,10.2.1材料的选择 10.2.2材料的预处理 10.2.3冰冻保护剂预处理 10.2.4降温冰冻操作 10.2.5化冻操作 10.2.6化冻材料的活力检测 10.2.7超低温种质保存实例,10.2.1材料的选择植物材料的种类、基因型、年龄、生理状态、抗寒性和形态结构等都对冷冻保存效果有很大影响。a.一般细胞分裂旺盛、体积小而原生质浓厚的分生细胞或比体积大而高度液泡化的细胞有利于超低温保存。b.细胞培养的阶段对超低温保存效果影响很大。实验表明，当培养细胞处于旺盛的对数分裂期时，抗冻能力和存活率较高。c.选用悬浮培养细胞，应先转移

7、到新鲜培养基上培养几天，使较多的细胞处于对数分裂期的幼龄状态。,d.材料大小也有影响，太大影响预培养效果，冻存易受冰晶伤害；太小则切取困难，而且增加切取时对材料的伤害。e.如果采用大田生长的植物的芽，最好选择在冬季取材。因为夏季生长的芽都不耐寒，而经秋冬季的低温锻炼后，植物体的抗冻能力提高，所以动机去才有较高的存活率,10.2.2材料的预处理预处理包括材料的预培养和低温预处理，目的是减少系孢子油水的含量，使细胞经受低温锻炼，以有效提高组织活细胞的抗冻能力。在冰冻保存前的预培养时常在培养基中加入一些可以提高材料抗冻能力的物质，如山梨酸醇、脱落酸、脯氨酸、和二甲基亚砜（dmso）等，最常用的方法是

8、增加培培养基中蔗糖的浓度。,将选好的材料在低温下锻炼数天，就有可能大大提高液氮保存的存活率。如：康乃馨的茎尖经4低温预处理14天，不仅存活率提高，分化率也从30%增至60%。在低温锻炼的过程中，细胞膜结构可能发生一定变化，细胞内保护性物质也会增多，从而增强了细胞对冰冻的耐受性。不同材料低温处理的温度和时间各不相同。,10.2.3冰冻保护剂预处理,10.2.3.1冰冻保护剂（cryoprotectant） 冰冻保护剂的特性：易溶于水，在适当浓度下对细胞无毒，化冻后容易从组织细胞中清除。 常用的冰冻保护剂：dmso、甘油、糖和糖醇（蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、甘露糖醇等）以及peg等。 冰冻保护剂多是

9、低分子量的中性物质，可以增加细胞膜的透性，加速细胞内的水流到细胞外结冰，在溶液中可以产生强烈的水合作用，提高溶液粘滞性，降低冰晶的形成和增长速度，稳定细胞膜结构，减少冰冻对细胞的有害影响。,10.2.3.2保护剂预处理配制保护剂时，应该将其溶解在培养基里，或是溶解在有糖或无糖的水中。为防止对细胞的渗透冲击，保护剂应在3060min内逐渐加入，如用甘油则加入速度需更慢。由于dmso有一定毒性，所以预处理应该在0左右的低温下进行。处理时间也不能过长，一般不宜超过1h。,10.2.4降温冰冻操作,10.2.4.1快冻法（rapid cooling method） 是将材料在0或其他预处理温度下直接放

10、入液氮内进行冷冻的方法。 10.2.4.2慢冻法（slow cooling method） 对于不抗寒的植物或含有大液泡和大量水分的成熟材料（包括悬浮培养的细胞）常在有冰冻保护剂存在的条件下，采用0.110/min的降温速度，使材料降温至-70左右，然后转到液氮中，或者以这种降温速度连续降温至-196，这种方法即慢冻法。,10.2.4.3两步冷冻法 这种方法是将快冻法和慢冻法结合，第一步用慢冻法降到一定的温度，使细胞达到适当的保护性脱水；然后第二步再放入液氮中速冻。 目前多数的工作是以每分钟0.54的速度降到-40左右，停留一段时间，使材料细胞内充分脱水，然后放入液氮。 10.2.4.4逐级冷

11、冻法 此法是在无程序降温仪等设备条件下的保存方法。先制备不同等级温度的溶液，如-10 、-15、-23 、-35 或-40 等；植物材料经保护剂预处理后，逐级通过这些温度，在每级温度中停留一定时间（一般46min），然后侵入液氮中。,10.2.4.5干燥冷冻法 这是一种先将植物材料置于干燥箱内或用真空干燥的方法使其脱水，然后侵入到液氮中保存的方法。 如将豌豆幼苗置于2729干燥箱内，使其含水量从72%77%下降到27%40%，再放入液氮，就可使材料免遭冻死。 若将细胞在真空下脱水，植物器官液氮保存后的存活率就更高。 不同植物和不同组织的最适脱水程度各不相同。 10.2.4.6包埋脱水法 包埋脱

12、水法是将材料用褐藻酸钙包埋后，先在含高浓度蔗糖的培养基中脱水，再用无菌空气流或硅胶脱水，然后放入液氮储存。,10.2.4.7玻璃化法 玻璃化法（vitrification）是液体转变为非晶体（玻璃化）的固化过程。 其基本过程是将样品经高浓度的保护剂（玻璃化溶液）快速脱水处理后，直接放入液氮中储存。玻璃化冰冻过程中水分子没有发生重排，不行成冰晶，也不产生结构和体积的改变，因此不会对材料造成伤害。 这种方法具有设备简单、操作方便、冻存效果好等优点。 玻璃化法也可以和包埋法结合使用，即先将材料用褐藻酸钙包埋，然后再用玻璃化保护剂脱水后放入液氮储存，叫包埋玻璃化法。,10.2.5化冻操作,不论是检测冰

13、冻保藏材料的存活情况，还是因其他原因要取用材料，都需将其取出化冻并再培养，但不同材料化冻时也需要选用合适的方式，以避免在化冻过程中产生细胞的次生结冰，并防止在化冻吸水过程中水的渗透冲击造成细胞膜的损坏。 10.2.5.1快速化冻 快速化冻即将液氮保存的材料在3540温水中化冻的方法。这样的处理因化冻速度快，细胞内水分来不及再次形成冰晶就已经完全化冻，可避免对细胞结构造成的破坏，因此大多数材料都采用快速化冻的方法。 玻璃化冻存的材料也要求快速化冻，一般在2540的水浴中进行。,10.2.5.2慢速化冻法 慢速化冻是在0、23或室温下进行化冻，该方法适合细胞含水量较低的材料。例如木本植物的冬芽超低

14、温保存后，需要在0低温下进行慢速化冻才能达到良好效果。 需要注意的是，冰冻后的组织和细胞十分脆弱，摇动和转移操作时都应十分小心，避免机械损害。 光照恢复生长也有影响。多数实验表明，超低温保存材料恢复生长初期，在黑暗或弱光下效果较理想,10.2.6化冻材料的活力检测,检验化冻材料的生活力和存活率的最根本方法是再培养，再在培养过程中，还可以观察细胞的生长速率、愈伤组织的形成和生长情况以及分化长生新植株的能力和次级代谢物生产水平等。也可用edta、ttc等染色的方法进行快速检测，但染色法只能作为生活力的预测指标，不能代替再培养法。,10.2.7超低温种质保存实力,10.2.7.1豌豆茎尖分生组织的超

15、低温保存 种子用70%酒精迅速漂洗，10%漂白粉消毒30min无菌蒸馏水洗4次。将消毒种子无菌播种子铺有湿润滤纸的培养瓶或培养皿内，2528暗培养。萌发生长45天后，在解剖镜下切取带一对叶原基的茎尖分生组织。 将切取的茎尖分生组织接种于b5固体培养基上，内含0.5mol/l 6-ba、0.5%dmso。置光照16h，温度20（日温）/15 （夜温）的生长箱中预培养48h。 预培养后，将培养瓶浸入冰浴中降温2h.将茎尖分生组织转移到冰浴中预冷的具有10ml液体b5培养基的离心管中，缓慢加入等体积的预冷的10%dmso，在30min内加完，使dmso的最终浓度为5%，然后放置1030min。密封离心管口，以每分钟降低0.6 的速度慢速降温到-40 ，然后浸入液氮中。 保存一定时间后的材料在37 迅速化冻，经再培养可分化成苗，植株再生率在70%以上。,10.2.7.2柑橘茎尖的玻璃化超低温保存,材料为枳壳（poncirus trifoliata）、红肉脐橙等4个品种将长度约为10mm的不同品种柑橘茎尖于5%dmso+5