蛋白质组学及技术介绍

1、概念蛋白质组是所有由基因组表达的蛋白质，在细胞的整个生命过程中表达后被修饰。蛋白质组学是蛋白质组学概念的延伸。它是对蛋白质的大规模研究，从蛋白质和生命本质的层面研究和发现生命活动的规律和重要生理病理现象的本质，揭示基因活动的动态表达。蛋白质水平的分析不仅为生物分子系统提供了最有效的实时分析模型，而且获得了在dna和rna水平难以获得的信息。蛋白质研究有两个主要方面：1 .结构蛋白质组学：主要研究蛋白质表达模型，包括蛋白质氨基酸序列分析、空间结构分析、分析物种分析和数量测定；2.功能蛋白质组学：主要研究蛋白质的功能模式，包括蛋白质的功能和蛋白质之间的相互作用。蛋白质组学可以分为三个主要领域：1。

2、用于大规模蛋白质鉴定的蛋白质的微观特征及其翻译后修饰；2.“差异显示”蛋白质组学提供了蛋白质水平和广泛疾病之间的强有力的应用比较；3.使用特定的分析技术，如质谱(包括串联质谱和生物质谱)或酵母双杂交系统和其他新的蛋白质组学研究技术来研究蛋白质相互作用。研究技术，3，蛋白质分离策略：1，多维色谱，包括大小排阻色谱、离子交换色谱、反相高效色谱、疏水作用色谱等；2.多维电泳技术，包括二维凝胶电泳、自由流动电泳、毛细管区带电泳等。3.亲和方法，包括免疫印迹和亲和捕获；4.细胞器和膜复合体的分离。双向凝胶电泳：双向凝胶电泳的原理是，在第一个方向上，根据不同的等电点通过等电聚焦来分离蛋白质，在第二个方向上

3、，根据不同的分子量通过sds-page来分离复杂蛋白质混合物中的蛋白质。二维码有很好的分辨率。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳或单相ief的最佳分辨率仅为100个蛋白质，而二维电泳约有3000个蛋白质。蛋白质： 1肽段的鉴定。氨基和羧基末端分析，如edman 2。质谱，包括肽片段的质谱和串联质谱。质谱是指在电子流或强电场等方法的轰击下，化合物分子在真空中电离成离子，同时某些化学键有规律地断裂，产生不同质量的带电离子。生物质谱是蛋白质组学研究中最重要的鉴定技术。其基本原理是根据样品分子电离后不同离子间的荷质比差来分离和测定分子量。经双向电泳分离的目的蛋白经胰蛋白酶水解(赖氨酸或精氨酸的-c端形

4、成的肽键水解)成肽段，这些肽段经质谱鉴定和分析。目前常用的质谱有两种：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱和电喷雾质谱。免疫沉淀技术：基于抗体和抗原之间的特异性结合，该技术不仅可以确定在生理条件下细胞或组织中的两种靶蛋白之间是否存在相互作用，还可以探索与已知蛋白相互作用的蛋白。其基本原理是在非变性条件下裂解细胞，将相互作用蛋白保留在细胞内，并将目标蛋白的抗体加入细胞裂解液中，使目标蛋白的相互作用蛋白在体内带电。洗脱，收集沉淀，分离，最后鉴定分离得到的蛋白质。该方法研究的蛋白质都是在体内翻译后修饰的，在自然状态下是可分离的相互作用的蛋白质复合物，可以反映正常生理条件下蛋白质之间的相互作用。蛋白质相互

5、作用2。酵母双杂交系统：该系统使用真核细胞来调节脱氧核糖核酸结合域，脱氧核糖核酸识别脱氧核糖核酸上的特定序列，并使激活域开始被调节基因的转录。将已知蛋白质x和待研究蛋白质y的基因分别与编码ad和bd的序列结合，然后通过载体质粒转移到同一酵母细胞中表达，产生两种融合蛋白。如果蛋白质x和y能相互作用，当它们在空间上接近时，ad和bd能形成一个完整的、活性的转录因子，然后开始转录并表达相应的报道基因；相反，如果x和y之间没有相互作用，报告基因就不会被表达。这样，通过报告基因的表达，可以确定是否发生了蛋白质相互作用。蛋白质芯片技术蛋白质芯片是一种新型的生物芯片，可以进行高通量的蛋白质功能分析。该技术的

6、实现是基于蛋白质探针在固体支持物(载体)表面的大规模整合，利用样品中标记或未标记的靶蛋白分子与探针反应，然后通过相应的方法如荧光法、放射性同位素法或未标记检测法对其进行检测。最后，通过计算机分析结果以获得高丰度表达的蛋白质。蛋白质组学应用，疾病研究，植物学医学研究，食品科学，遗传学和微生物学，在疾病和医学研究中的应用，1。发现新的疾病标记并鉴定疾病相关蛋白作为早期临床诊断标记。例如，雷等人利用蛋白质组学技术如2-de和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对膀胱癌患者的尿蛋白进行了分离和鉴定，获得了14个差异表达的蛋白，这些蛋白可能是膀胱癌诊断和检测的潜在尿液标志物。在疾病和药物的研究中，2。探索疾

7、病的发病机制和治疗。如polprasert等人应用蛋白质组学方法研究遗传性球形红细胞增多症中红细胞膜蛋白的变化，分离鉴定了56种差异表达蛋白，并通过蛋白网络分析了细胞死亡、细胞循环和遗传性及血液病三个重要的hs相关网络，为进一步研究和理解hs相关发病机制提供了参考。及其在疾病和药物研究中的应用。3.研究膜蛋白和膜相关蛋白刘等。采用比较膜蛋白质组学方法，对感染h5n1病毒6、12和14小时的人肺腺癌细胞a549进行分析鉴定，获得24种差异表达蛋白，其中57%为膜蛋白或膜相关蛋白。sirna技术鉴定了几种与病毒增殖相关的蛋白质。4.它为快速、特异和高通量的药物研究提供技术支持。林等用蛋白质组学技术

8、研究了阿霉素处理后人子宫癌细胞的蛋白表达变化，发现有37种差异表达蛋白，为阿霉素耐药的子宫癌细胞的治疗提供了诊断和治疗标记。蛋白质组学研究技术，蛋白质分离技术：二维凝胶电泳(2de)，二维荧光差异电泳(2d-dige)，等电聚焦电泳(ief)，液相色谱。多维色谱(mdc)、多维液相色谱(mdlc)蛋白质鉴定技术一级质谱：根据离子源不同，可分为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tof-ms)和电喷雾质谱(esi- ms)。二级质谱：肽质量指纹图谱(pmf)。新技术：稳定同位素特征标签生物质谱(siams)，itraq，定义：相对和绝对定量同位素标签(itraq)是一种在体外相同同位素

9、标记的相对和绝对定量技术，由ab sciex公司开发。该技术使用多种同位素试剂标记蛋白质多肽的n末端或赖氨酸侧链基团，并可通过高精度质谱仪串联分析比较多达8个样品中的蛋白质表达。它是近年来定量蛋白质组学中常用的高通量筛选技术。原理：itraq技术使用四个或八个同位素编码的标签，专门标记多肽的氨基，然后进行串联质谱分析，可以同时比较四个或八个不同样品中蛋白质的相对或绝对含量。伊曲克试剂伊曲克试剂是一种含有小分子和重元素的化学物质，包括三个部分：1。一端是记者组2。另一端是肽反应性基团3。中间部分是一个平衡群报告群：其质量为114da、115 da、116 da和117da，因此有4个itraq试

10、剂；肽反应性基团：样品中几乎所有的蛋白质都可以通过连接带有肽n端和赖氨酸侧链的报道基团进行标记；平衡组：质量为31 da、30 da、29 da和28 da，因此四种itraq试剂的分子量均为145 da，且用itraq标记的同一肽的m/z相同。伊曲克试剂结构，伊曲克试剂标记原理，来自四个不同来源的相同蛋白质样品在一级质谱上具有相同的性能；平衡基团在二次质谱中失去了中性。报道基团在二次质谱中产生114、115、116和117个报道离子。同一蛋白质在不同样品中的表达率可以通过分析报告离子的峰强度比来分析。操作流程、仪器、tripletoftm5600系统是快速评估药物代谢稳定性、体内药物特性和最

11、终代谢物鉴定的理想平台。在最快收集速度的条件下，可以用高分辨率和准确的质谱数据完成无与伦比的蛋白质定性鉴定。技术特征，精确定量：每组最多可并行比较8个样品，标记效率高达97%,可减少不同组造成的样品处理和实验误差。高效样品分离：采用scx-高效液相色谱分离，实现自动化操作。高识别率：对组织或细胞中尽可能多的蛋白质进行系统和全面的研究，可以识别多达6000种蛋白质。适用范围广：没有物种特异性限制，理论上适用于所有物种。itraq技术不仅能发现细胞质蛋白，还能发现膜蛋白、核蛋白和胞外蛋白。出色的仪器性能：基于高分辨率( 105)和高质量精度(1ppm)质谱平台，可以获得更精确的结果。itraq技术

12、可检测低丰度蛋白质、强碱性蛋白质、小于10kd或大于200kd的蛋白质。荧光差异凝胶电泳，基于二维电泳的荧光标记原理，特点是基于传统二维电泳技术的dige荧光差异蛋白表达分析系统，结合多种荧光分析方法，在同一凝胶上分离出多个不同荧光标记的样品，并首次引入内标概念，大大提高了结果的准确性、可靠性和重复性。在dige技术中，每个蛋白质点都有自己的内标，软件根据每个蛋白质点的内标自动校准其表达，以确保检测到的蛋白质丰度变化是真实的。dige技术可以检测出样本之间不到10%的蛋白质表达差异，统计可靠性超过95%。实验过程中，仪器荧光差示凝胶电泳系统中的埃坦dige2d试剂1。样品标记(1)染料cy2、cy3和cy5与蛋白质赖氨酸的-氨基反应产生三