第14章 免疫细胞的分离及检测技术.ppt

1、第十四章 免疫细胞的分离及其表面标志检测技术,第一节 免疫细胞的分离 一、 外周血单个核细胞分离 二、 淋巴细胞的分离 三、 T细胞和B细胞的分离 四、 T细胞亚群的分离,第二节 淋巴细胞标志及亚群分类 一、 细胞表面标志及亚群 二、 B细胞表面标志 三、 NK细胞表面标志 第三节 其他的免疫细胞 第四节 免疫细胞表面标志的检测及应用 一、免疫细胞表面标志的检测方法 二、 淋巴细胞表面标志检测的临床意义,思考题 小结,免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞，免疫细胞检测是观察机体免疫状态的一种手段。它包括各类免疫细胞的分离免疫细胞的鉴定计数和功能测定,不同细胞密度不同 不同细胞表面生物

2、学特性不同 不同细胞表面分化抗原不同,第一节 免疫细胞的分离,淋巴细胞分离的方法很多，这些方法主要是根据细胞表面标志、理化性状及功能等方面的差异而设计的。,细胞分离基本原理,外周血单个核细胞分离 淋巴细胞的分离 T细胞和B细胞的分离 T细胞亚群的分离,一、外周血单个核细胞分离,外周血单个核细胞（peripheral mononuclear cells, PMNC）包括淋巴细胞和单核细胞（monocyte）。 聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll)分离液法 主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。,不同细胞密度不同,人的红细胞密度：1.093 粒细胞密度：1.092 淋巴

3、细胞和单核细胞密度：1.0761.090 血小板密度：1.0301.035 聚蔗糖泛影葡胺分层液1.0770.001 Ficoll密度为1.020-浓度为6% hypaque密度为1.200-浓度为34%,不同细胞密度不同,肝素,记数 染色,分层液,分层液,用1.0770.001的分层液可将细胞分离,密度梯度离心(Ficoll)离心,二 、淋巴细胞分离,单核细胞去除法 贴壁粘附法 吸附柱过滤法 磁铁吸引法 Percoll 分离液法 （连续密度梯度离心）,PBMC悬液主要含淋巴细胞，但还混有单核细胞、粒细胞、红细胞、血小板可采用下列方法去除，以获得高纯度淋巴细胞及其亚群。,（一）红细胞的去除：

4、采用无菌蒸馏水低滲裂解法或0.83%氯化铵处理法。 （二）血小板的去除 离心洗涤23次，可去除大部分血小板。某些疾病情况下，可用胎牛血清梯度离心法去除。,（三）单核细胞和粒细胞的去除 1.粘附去除法：具有黏附玻璃、塑料和葡聚糖凝胶的特性。洗脱液中主要含淋巴细胞。 2.羰基铁粉吞噬法：吞噬细胞具有吞噬羰基铁粉的能力，吞噬后再用聚蔗糖-泛影葡胺分层液梯度离心，则单核细胞沉积管底。也可用磁铁吸引法。,3、Percoll分层液法,Percoll分层液是经过聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒混悬液，对细胞无毒性无刺激， Percoll混悬液的硅胶颗粒大小不一，经高速离心后可形成一个连续密度梯度，可将密度不同的

5、细胞分离纯化。,（二）Percoll分层液法,方法评价：是新型密度梯度离心分离剂，有易成等渗、黏度低、无毒性不引起细胞聚集,E花环沉降法 尼龙毛柱分离法,三、T细胞和B细胞的分离,三、T细胞和B细胞的分离,1.E花环分离法 原理：成熟的T细胞表面表达 SRBC-R，即E受体。T细胞能与SRBC结合形成E花环，而B细胞 则不能。经F-H分层液密度梯度离心，E花环形成细胞因密度增大而沉积于管底。用低渗法裂解花环中的SRBC，即可获得纯化的T细胞。悬浮在分层液界面的细胞群富含B细胞,E花环分离法: T细胞E受体+SRBC E花环 梯度离心 花环沉于管底 低滲法裂解SRBC 获纯化的T细胞。,1、E花

6、环分离法,三、T细胞和B细胞的分离,2.尼龙棉分离法 原理：B细胞易黏附于尼龙棉纤维（聚酰胺纤维） 表面，而T细胞则不具此能力，借此可将 T细胞与B细胞分离。 技术要点：用Focoll分层液分离血中的PBMC；将 PBMC悬液加入尼龙棉充填聚乙烯塑料管内；孵 育；洗脱；流出液内含有T细胞。重复灌洗除 去管内残留的T细胞，再用洗脱液边洗边挤压 塑料管，可得到B细胞,三、T细胞和B细胞的分离,四、T细胞亚群的分离,亲和板结合分离法 磁性微球分离法 荧光激活细胞分离仪分离法,1.亲和板结合分离法 原理：用特异性抗体包被塑料平皿或培养板，表 达特定膜抗原的细胞即与相应抗体结合而被吸 附于平皿或培养板表

7、面，悬液中为不表达特定 膜抗原的细胞 技术要点：用已知的McAb包被反应板，孵育，洗 涤；加入待分离的细胞悬液，孵育。抗原阳性 细胞吸附反应板，抗原阴性细胞存在于非吸附 细胞悬液中。,四、T细胞亚群的分离,原理：将抗特异细胞表面的抗体致敏到磁珠上， 形成IMB。待它与混合体系中的细胞反应后，利 用磁力的作用，使与致敏磁珠结合的细胞与其他 物质分离，达到纯化、分离的目的。 分离方式： 阳性分离 直接从细胞混合液中分离出靶细胞；阴性分离 用磁珠去除无关细胞，使靶细胞得以纯化。,四、T细胞亚群的分离,2.免疫磁珠(immunomagnetic beads，IMB)分离法,技术要点：以免疫磁珠纯化人C

8、D4+细胞为例 抗CD4+抗体包被磁珠 CD4+细胞的分离 磁珠与淋巴细胞的分离 阳性分离涉及到磁珠与细胞的解离。方法是37过夜，也可用商品化的分离系统进行抗原与抗体的解离，使解离的细胞既无抗体残留，又不改变其功能和活性，,四、T细胞亚群的分离,2.免疫磁珠(immunomagnetic beads，IMB)分离法,评价：IMB分离细胞方法简便、快速、无需特殊设备，且分离细胞的纯度高，产率大，广泛应用 应用：人类各细胞的分离；肿瘤的早期诊断； 骨髓移植物的预处理，去除残留肿瘤细胞， 提高移植成功率；某些科研和医疗工作中特 殊细胞的分离或清除；细胞表面分子的检测,四、T细胞亚群的分离,2.免疫磁

9、珠(immunomagnetic beads，IMB)分离法,磁珠大小可以选择,大小免疫磁珠分离细胞的特点比较,免疫磁珠法细胞分选过程,免 疫 磁 珠 细 胞 分 选 装 置,原理：用流式细胞术可自动化地对单个细胞 进行多参数定量测定分析，从而可分选出用 特异性荧光抗体标记的阳性细胞。用流式细 胞术分离细胞准确快速，纯度达90%99%， 细胞活性不受影响。缺点是费用昂贵，拟分 离的细胞在混合群体中含量过低时，耗时 较长才能获得所需数量细胞。,四、T细胞亚群的分离,3、荧光激活细胞分离仪分离法,荧光激活细胞分离仪分离法,全自动细胞分选系统,流式细胞分析仪,第二节 淋巴细胞标志及亚群分类,常用于鉴

10、定和检测淋巴细胞表面标志是簇分化抗原（Cluster of differentiation，CD）。,细胞表面分化抗原（CD抗原）,适用于T、B细胞的分离 已知CD抗原细胞亚群的分离 未知CD抗原细胞亚群的分离 （阴性分选）,一、T细胞表面标志及其亚群,CD3+ CD4+ CD8 - 辅助性T细胞 （help T cell,Th） CD3+ CD4- CD8+细胞毒性T细胞 （cytotoxic T cell,Tc or CTL） CD4+ CD25+调节性T细胞 （regulatory T cell,Tr or Treg）,T细胞表面标志,所有的T胞均有共同的标志性抗原，不同功能的T细胞亚群

11、又具有各自的标志性抗原,二、B细胞表面标志,SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，部分CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。 CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的B细胞。,B细胞表面标志,外周成熟的B细胞分为B1细胞和B2细胞两个亚群。B2细胞主要是外周成熟的常规检测的B细胞,三、NK细胞表面标志,人类NK细胞表面标志主要以CD16、CD56来认定，临床上将CD3- CD56+ CD16+ 淋巴细胞认定为NK细胞。,第三节 其他的免疫细胞

12、,抗原提呈类细胞表面标志,第四节 免疫细胞表面标志的检测及应用,免疫细胞表面标志的检测方法 淋巴细胞表面标志检测的临床意义,一、免疫细胞表面标志的检测,抗体致敏细胞花环法 免疫细胞化学法 免疫荧光法 流式细胞分析法,1、抗体致敏细胞花环法, 抗CD3单克隆抗体+醛化的红细胞致敏红细胞+待测细胞CD3阳性细胞形成花环 受检细胞周围黏附3个和3个以上红细胞者为花环形成细胞。计算花环形成细胞与淋巴细胞之比。 方法评价：简便易行，不需特殊设备，试剂相对便宜，是经典的检测方法。但影响因素多，结果不太稳定。,2 、E花环试验 （1）Et花环（总花环） T细胞 SRBC E花环 镜检计数可得总花环百分率。

13、Et代表T总数。 正常参考值 6070,4度过夜,（2）Ea花环（活性花环） T细胞 SRBC 低速短时离心 立即推片镜检 计数E花环求百分率。正常参考值2040,3、间接荧光免疫法 方法：分离PBMC鼠抗人CD3单抗（CD4、CD8 ）荧光第二抗体 荧光显微镜下观察 有荧光的细胞即为阳性细胞。 T细胞亚群正常参考值为： CD3T细胞6080 CD4T细胞5560 CD8T细胞2030 CD4T细胞： CD8T细胞2：1 有条件时，可在用流式细胞仪计数,4、SmIg的检测：SmIg为B细胞所特有 B细胞荧光素或酶标记的抗人Ig抗体 荧光显微镜检或酶组化法检测SmIg。 正常人外周血中SmIg细

14、胞为812。,5.Fc受体和补体受体的检测 Fc受体EA花环试验 原理：EAB细胞 形成EA花环 E：牛；鸡；绵羊；人红细胞 A：E的相应抗体 B细胞上有Fc受体,6 、补体受体EAC 花环试验 原理：EA+C+B细胞 形成EAC花环 红细胞抗体补体B细胞：EAC E A C3b E：SRBC A：抗SRBC（IgM） C：C3b或C3d B细胞：表面有补体C3b受体,（可激活补体）,二、淋巴细胞表面标志检测的临床意义,淋巴细胞表面标志检测是评价免疫功能的重要指标。 对CD4+和CD8+T细胞的测定，有助于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反应的监测。,临床常见疾病中的T 淋巴细胞的变化,

15、思考题,1.免疫细胞都包括哪些细胞？为什么要将其分离纯化？ 2.淋巴细胞有哪几类细胞？能用形态学的方法加以区别吗？ 3.将细胞分离的原理有哪些？各有什么特点？ 4.形态学相同的一类细胞为什么还要分亚群？ 5.T细胞和B细胞进一步区分亚群的依据是什么？,6.什么是细胞表面标志？其作用是什么？ 7.细胞表面标志的检测方法有哪些？ 8.利用细胞表面标志（CD抗原）分离细胞的方法有哪几种？ 9.T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞的主要生物标志是什么？ 10.淋巴细胞表面标志检测的临床意义是什么？,小 结,淋巴细胞并不是功能单一的群体，但其在光学显微镜下的形态基本是一样的，因此要对其进行进一步的分类和观察就不能采用形态学的方法，而要依靠对其表面标志的检测。常用于鉴定和检测计数淋巴细胞的表面标志是C