第五章化学发光免疫分析

1、第五章 化学发光免疫 分析技术,第一节 慨 述 一、化学发光 二、化学发光效率 第二节 化学发光剂和标记技术 一、化学发光剂 二、发光剂的标记技术,第三节 化学发光免疫分析的类型 一、直接化学发光免疫分析 二、化学发光酶免疫分析 三、电化学发光免疫分析 四、临床应用,第一节 概 述,发光免疫分析:是将发光分析和免疫反应相结合而建立起来的一种新的检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术。,放射免疫技术,酶免疫技术,发光免疫技术,三大经典标记技术,发光:是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并释放光子的过程。 根据形成激发态分子的能量来源不

2、同可分为: 光照发光、生物发光、化学发光等。,光照发光（photoluminescence）是指发光剂（荧光素）经短波长的入射光照射后，电子吸收能量跃迁到激发态，在其回复至基态时，发射出较长波长的可见光（荧光）。,生物发光（bioluminescence）是指发生在生物体内的发光现象，如萤火虫的发光，反应底物为萤火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，利用ATP能，生成激发态氧化型荧光素，它在回复基态时多余的能量以光子的形式释放出来。,生活中常见的化学发光现象,化学发光（chemiluminescence）是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。某些物质(发光剂)在化学反应时，吸收了反应过程中所产生

3、的化学能，使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。,一、化学发光,一些化学反应能释放足够 的能量把参加反应的物质激 发到能发射光的电子激发态， 若被激发的是一个反应产物 分子，则这种反应过程叫直 接化学发光。反应过程可简单地描述如下： A十B C* C* C h 其中为光子，C*表示C处于单线激发态。,若激发能传递到另一个未参加化学反应 的分子D上，使D分子激发到电子激发态， D分子从激发态回到基态时发光，这种过 程叫间接化学发光。反应过程可表示如下： A十B C* C*十D C十D* D* D十h,

4、化学发光效率决定于生成激发态产物分子的化学激发效率（CE）和激发态分子的发射效率（EM）。化学发光反应的发光效率、光辐射的能量大小以及光谱范围，完全由发光物质的性质所决定，每一个发光反应都具有其特征性的化学发光光谱和不同的化学发光效率。,二、化学发光效率,第二节 化学发光剂和标记技术,在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，称为化学发光剂或发光底物。,一、化学发光剂,能作为化学发光剂的条件： 发光的量子产率高； 它的物理-化学特性要与被标记或测定的 物质相匹配； 能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物； 其化学发光常是氧化反应的结果； 在所使用的浓度范围内对生物体没有毒

5、性。,直接化学发光剂 直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。,1. 吖啶酯 在碱性条件下被H2O2氧化时,发出波长为470nm的光，具有很高的发光效率，其激发态产物N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。,2三联吡啶钌 三联吡啶钌 RU(bpy)32+是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。,三联吡啶钌,电化学发光剂反应原理, 酶促反应发光剂： 是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底 物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂 称为酶促反应发光剂。,1鲁米诺及

6、其衍生物 2AMPPD,1鲁米诺,鲁米诺发光原理,鲁米诺与氢氧化物反应时生成了一个双负离子（Dianion），它可被过氧化氢分解出的氧气氧化，产物为一个有机过氧化物。该过氧化物很不稳定，立即分解出氮气，生成激发态的3-氨基邻苯二甲酸。激发态至基态转化中，释放的能量以光子的形式存在，波长位于可见光的蓝光部分。,鲁米诺增强发光反应原理,2AMPPD 3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷,1. 碳二亚胺（EDC）缩合法,二、发光剂的标记技术,2. 过碘酸钠氧化法,3重氮盐偶联法,4. N-羟基琥珀酰亚胺活化法,1发光剂的选择 2被标记物质的性质 3标记方

7、法的选择 4原料比 5标记率 6温度 7纯化与保存,影响标记的因素,第三节 化学发光免疫分析的类型,用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光 。 由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。,一、直接化学发光免疫分析,发光,Y,Y,Y,磁微粒,被测抗原,+,抗体,+,带丫啶酯标记物抗体,冲洗后,- 夹心法,（1） 加入H2O2 （pH1

8、0）,（2） 加入碱 （pH10）,直接化学发光的机理,磁微粒模式图,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,特点 抗原和抗体结合与未结合部分的易分离,磁微粒技术,化学发光酶免疫分析（chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶(ALP)来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物(发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至

9、计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。,二、化学发光酶免疫分析,该分析系统采用辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体(或抗原)，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶（HRP）标记抗体复合物，这时加入鲁米诺发光剂、H2O2和化学发光增强剂使产生化学发光。, 辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析,辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图,该分析系统以碱性磷酸酶 标记抗体(或抗原)，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，这时加入AMPPD发光剂，碱性磷酸酶使AMPPD脱去磷酸根基团而发光。, 碱性磷酸酶

10、标记的化学发光免疫分析,碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图,分析步骤,电化学发光免疫分析（electrochemiluminescence immunoassay， ECLIA）是以电化学发光剂三联吡啶钌标记 抗体(抗原)，以三丙胺(TPA)为电子供体， 在电场中因电子转移而发生特异性化学发光 反应，它包括电化学和化学发光两个过程。,三、电化学发光免疫分析,在电化学发光免疫分析系统中，磁性微粒为固相载体包被抗体(抗原)，用三联吡啶钌标记抗体(抗原)，在反应体系内待测标本与相应的抗原 (抗体)发生免疫反应后，形成磁性微粒包被抗体-待测抗原-三联吡啶钌标记抗体复合物，这时将上述复合物吸入流动室，

11、同时引人TPA缓冲液。当磁性微粒流经电极表面时，被安装在电极下面的电磁铁吸引住，而未结合的标记抗体和标本被缓冲液冲走。与此同时电极加压，启动电化学发光反应，使三联吡啶钌和TPA在电极表面进行电子转移，产生电化学发光，光的强度与待测抗原的浓度成正比。,电化学发光免疫分析示意图,电化学发光免疫测定示意图,标记磁颗粒在电场中发光工作示意图,发光免疫分析基本操作步骤（一步法）,待测样品,标记抗体或抗原,洗涤去除未结合的反应物,发光底物,仪器检测,包被抗体或抗原的反应管,反应30-60分钟,反应0-5分钟,发光免疫分析基本操作步骤（二步法）,待测样品,洗涤去除未结合的反应物,发光底物,仪器检测,包被抗体

12、或抗原的反应管,反应30-60分钟,反应0-5分钟,标记抗体或抗原,洗涤去除未结合的反应物,反应30-60分钟,化学发光免疫分析的优点,1、灵敏度高： 这是CLIA关键的优越性，其灵敏度可达10-16/-21mol/L（RIA为10-12mol/L）。又如化学发光底物（如AMPPD）可检测出的碱性磷酸酶的浓度比显色底物要灵敏5105倍。,几种标记免疫技术灵敏度的比较,酶标,荧光,放免,发光,灵敏度(mol/L),10-18 10-15 10-12 10-9,发光技术 临床免疫分析划时代的进步,以TSH(促甲状腺素)为例,第一代 TSH检测试剂盒,普通放免 功能灵敏度1-2mIU/L 基本无法测

13、到 正常值下限以下 的血清TSH浓度 对甲亢的诊断意义不大,固相放免 功能灵敏度 0.1-0.2mIU/L 在甲亢的诊断中 开始发挥作用,第二代 TSH检测试剂盒,发光免疫 功能灵敏度 0.01-0.02mIU/L 成为甲亢诊断的 首选指标之一,发光免疫 功能灵敏度 0.001-0.002mIU/L 一系列新的临床现象 改写了垂体甲状腺轴 的调控状态,第三代 TSH检测试剂盒,第四代 TSH检测试剂盒,2线性范围宽： 发光强度在46个量级之间与测定物质浓度间呈线性关系。这与显色的酶免疫分析吸光度（OD值）为2.0的范围相比，优势明显。也优于放射免疫分析技术。,几种标记免疫技术线性范围的比较,酶

14、标,荧光,放免,发光,线性范围,105 104 103 102,3、安全性好： 彻底消除了放射性危害，环保、安全。 到目前为止，还未发现CLIA的危害性。,4、试剂有效期长 有效期可长达1年以上，放射免疫分析由于放射性同位素的衰变，一般有效期只有一个月，而酶免的底物贮存性差，都无法与化学发光相比，有效期长可以降低使用成本，利于推广应用。,几种标记免疫试剂的有效期比较,酶标,荧光,放免,发光,有效期（月）,18 15 12 9 6 3 0,5、光信号持续时间长 辉光型（glow type）的CLIA产生的光信号持续时间可达数小时甚至一天。简化了实验操作及测量。容易实现连续、动态、重复测定 6、分

15、析方法简便快速 绝大多数分析测定均为仅需加入一种试剂（或复合试剂）的一步模式，容易实现自动化。,7、结果稳定、误差小 样品系直接自己发光，不需要任何光源照射，免除了各种可能因素（光源稳定性、光散射、光波选择器等）给分析带来的影响，使分析结果灵敏稳定可靠。,8、临床应用广 1）甲状腺激素 2）生殖激素 3）肾上腺/垂体激素 4）贫血因子 5）肿瘤标记物 6）感染性疾病 7）糖尿病 8）心血管系统 9）病毒标记物 10）骨代谢 11）过敏性疾病 12）治疗药物监测,1什么是发光免疫分析？什么是化学发光免疫分析？ 2化学发光与荧光的区别？化学发光反应的条件？ 3什么叫化学发光剂？化学发光剂必须具备那些条件？ 4吖啶酯化学发光的原理和特点是什么？ 5酶促反应的发光剂有哪些？其发光原理和特点是？ 6三联吡啶钌发光的原理和特点是什么？ 7三丙胺在电化学发光中起什么作用？ 8. 发光剂的标记有那些方法？影响因素有那些？ 9什么