分子生物学研究方法课件

1、分子生物学研究方法,第七章 分子生物学研究方法,第一节 重组DNA技术回顾 第二节 DNA基本操作技术 第三节 RNA基本操作技术 第四节 SNP的理论与应用 第五节 基因克隆技术 第六节 蛋白质组与蛋白质组学技术,分子生物学研究方法,第一节 重组DNA技术回顾,一、重组DNA技术发展史上的重大事件,第一，在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者：即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；,分子生物学研究方法,第二，50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制，解决了基因的自我复制和世代交替问题；,第三，50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说

2、，成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。,分子生物学研究方法,但是： 当时由于缺乏有效的分离和富集单一DNA分子的技术，科学家无法对这类物质进行直接的生化分析。随着DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生与发展。,分子生物学研究方法,重组DNA技术（recombination）： 是应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。,分子生物学研究方法,工具酶： 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） DNA

3、连接酶（DNA ligase） 工具酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件。,分子生物学研究方法,（一）限制性内切酶(RE),1、概念：一类能识别和切割双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶。 2、分类： I型 、II型 、型,分子生物学研究方法,类型II：识别位点和酶切位点一致，具特异性。单体酶，性质稳定，Mg2+为辅助因子。目前已分离了数百种。,类型I：识别的DNA序列长约十几个bp；酶切位点在距识别位点1kb左右处随机切割，非特异性；复合酶，无使用价值。,类型：酶切位点在识别位点下游24-26bp处， 非特异性。 单体酶，如Hga I: GACGCnnnnn,分子生物学研

4、究方法,3、II型限制性内切酶的基本特性,(1)识别dsDNA分子中48 bp的特定序列 (2)大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 (3)识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构,分子生物学研究方法,EcoRI等产生的5粘性末端 5 G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 3 3 C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5 EcoRI 37 5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3 3 C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 退火4-7 5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 3 3 C-G-A-C-T-T-A-A G

5、-C-T-C 5 P OH,分子生物学研究方法,（二）DNA连接酶(ligase),将两段DNA片段连接起来的酶称为DNA连接酶。 1、E.coli DNA ligase: 连接粘端,催化需要NAD+参与 2、T4DNA ligase: 连接粘端和平端，催化需要ATP参与 都不连接单链,分子生物学研究方法,DNA连接酶的基本性质,分子生物学研究方法,二、基因克隆的载体,克隆用载体：是指具备自我复制能力的DNA分子。 常见的分子克隆载体有：病毒、噬菌体、质粒。,克隆用载体的选择,具备复制原点，能够自我复制,具备适合的酶切位点，且不在原点,具有筛选指标,对抗菌素的抗性,基因产物的显色反应,分子生物

6、学研究方法,载体的功能 运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件,分子生物学研究方法,三、基因克隆的操作,1、从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段；,2、在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子；,分子生物学研究方法,3、感受态细胞的制备氯化钙法,第一次摇菌,第二次摇菌,离心收集细菌,0.1M CaCl2 重悬细胞 , 冰浴30 min,离心、重悬重复一次,分子生物学研究方法,4、转化（transformation）,

7、感受态细胞与连接产物轻轻混匀, 冰浴30 min， 42水浴热激6090 s，快速冰浴2 min加液体LB振荡培养，使细胞复苏。,分子生物学研究方法,5、筛选（screening）, 根据重组载体的表型 抗药性（Ampr 、Tetr） 其他mark（ -互补筛选） 根据DNA限制酶的酶谱分析 PCR反应,分子生物学研究方法,基因克隆流程示意图,分子生物学研究方法,带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链，依靠无反应活性的稳定的介质（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，在电场中以一定的迁移率从负极移向正极。根据核酸分子大小不同、构型的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分

8、开。,一、核酸的凝胶电泳,（一） 基本原理：,第二节 DNA基本操作技术,分子生物学研究方法,电泳迁移率：电泳分子在电场作用下的迁移速度。 与电场强度和电泳分子所带的净电荷成正比。 与分子的摩擦系数成反比，摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数。 支持介质：稳定，无反应活性；,分子生物学研究方法,（二）种类 1) 按凝胶材料分: 聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶电泳 2) 按电泳装置分: 水平式/琼脂糖凝胶; 竖式/聚丙烯酰胺凝胶 3) 两种方法比较：分离效果和分离范围; 操作难易,分子生物学研究方法,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖是从红色海藻产物琼脂中提取的一种线性多糖聚合物。将琼脂糖粉未加热到溶点后凝

9、固，便会形成良好的介质，其密度由琼脂糖的浓度所决定。,特点：分辨能力低，但应用范围广，适用于较大分子的分析。适于分离 200 bp 50 kb 的 DNA 片段。操作简便。,分子生物学研究方法,分子生物学研究方法,聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂过硫酸铵和加速剂 TEMED ( 四甲基乙二胺） 的作用下聚合而成。,聚合时，由单体丙烯酰胺聚合成链状物，由交联剂甲叉双丙烯酰胺将链与链交联成网状，形成立体的不溶于水的凝胶。,分子生物学研究方法,特点：分辨能力高，但应用范围小，适用于较小分子的分析。适于分离 5 bp 500 bp 的

10、 DNA 片段。操作复杂。,核酸分子的染料,溴化乙锭（EB），因具有扁平分子的空间结构，能插入到 DNA 分子或 RNA 分子的相邻碱基之间，并在300nm 波长的紫外光照射下发出荧光。,分子生物学研究方法,分子生物学研究方法,分子生物学研究方法,二、细菌转化,细菌转化（transformation）是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。提供转化的DNA菌株叫供体菌株，接受转化的DNA菌株叫受体菌株。 目前常用的转化方法有CaCl2法(化学转化法)和电转化法。,分子生物学研究方法,感受态细胞的制备氯化钙法,分子生物学研究方法,转化（transf

11、ormation）,感受态细胞与连接产物轻轻混匀, 冰浴30分钟， 42水浴热激6090秒，快速冰浴2分钟加液体LB振荡培养，使细胞复苏。,分子生物学研究方法,三、 PCR基因扩增,聚合酶链式反应（polymerase chain reaction )，即 PCR 技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。,分子生物学研究方法,PCR特异性，即所扩增片段是由两个人工合成的引物序列决定的。,分子生物学研究方法,PCR反应原理,变性 退火 延伸,分子生物学研究方法,反应体系的成分,耐热的DNA聚合酶,引物,d NTP,模板 DNA,分子生物学研究方法,温度循环参数,变性：双链DNA分子

12、加热分离成两条单链DNA分子的过程。 变性温度：是指双链DNA分子50发生变性时的温度，一般为9495,分子生物学研究方法,退火：两引物分别与两条DNA的两侧序列特异性互补，形成双链的过程称为退火。 退火温度一般在5065 之间，具体温度与引物长度、碱基组成以及浓度有关。,分子生物学研究方法,延伸：在适宜条件下，DNA聚合酶以单链DNA为模板，以4 种脱氧核苷三磷酸（d NTP )为底物 , 在引物的诱导下，按 5 3方向复制互补DNA的过程。 延伸温度一般为7075 ，此时DNA聚合酶活性最高。,分子生物学研究方法,时间参数,变性时间：决定于DNA的复杂性，一般选取94 1 min, 因过长

13、的高温时间，会降低DNA聚合酶的活性；,退火时间：一般情况下取30 s1 min，因为引物比较短；,延伸时间：根据扩增片段的长度而定，一般在 1kb 以内的片段需延伸 1min , 更长的片段需相应延长时间。,分子生物学研究方法,引 物,1、引物长度在15 30 bp 之间， 引物的退火温度 Tm = 4(G+C) + 2(A+T),2、碱基随机分布 避免一连串相同碱基，引物本身不应存在互补序列，两条引物间也不应有互补性，尤其是3端；,分子生物学研究方法,3、G + C含量 G + C含量一般为40 60,4、引物3端碱基的特异性。,分子生物学研究方法,PCR技术的特点：,第一，特异性强 第二

14、，效率高 第三，灵敏度高 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平 能从100万个细胞中检出一个靶细胞 第四，对标本的纯度要求低 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA,分子生物学研究方法,分子生物学研究方法,四、实时定量PCR,实时定量PCR技术：指利用带荧光检测的PCR仪对整个PCR过程中扩增DNA的累积速率绘制动态变化图，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，从而测定终端产物的丰度。,分子生物学研究方法,荧光探针事先混合在反应管中，只有与DNA结合后才能被激发出荧光。,分子生物学研究方法,Repeat,非序列特异性的DNA结合的荧光探针,与双链D

15、NA结合； 与DNA结合后才发出荧光。,分子生物学研究方法,特异性的荧光探针,特异性的荧光探针是把荧光化合物标记到特异性的寡核苷酸上形成荧光标记的DNA探针。通过探针与PCR产物特异性的结合，在PCR过程中可对产物实现实时、定量检测。,分子生物学研究方法,TaqMan探针是一小段被设计成可以与靶DNA序列中间部位结合的单链DNA（一般为550 bp），并且该单链DNA的5和3端带有短波长和长波长两个不同荧光基团。,分子生物学研究方法,当探针单独存在时，由于荧光共振能量转移的作用而发生荧光猝灭。在PCR过程中，由于TaqDNA酶的5-3外切酶活性的作用，使探针的5端的基团被切断，加大了荧光基团间

16、的的距离，被切下来的荧光基团恢复荧光。 一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此，Taqman探针检测的是积累荧光。,分子生物学研究方法,d.NTPs,Thermal Stable DNA Polymerase,Primers,Add Master Mix and Sample,Denaturation,Annealing,Reaction Tube,l,应用TaqMan探针的实时定量PCR技术,分子生物学研究方法,5,3,l,分子生物学研究方法,实时定量PCR的绝对定量,Ct值： 指PCR扩增过程中，扩增产物荧光强度首次超过设定阈

17、值时，PCR反应所需的循环数。,分子生物学研究方法,模板起始浓度越高，Ct值越小 Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系,Ct值与模板起始浓度的关系,如果模板浓度增加1倍，Ct值就提前1个循环到达 如果模板浓度减少1倍，Ct值就滞后1个循环到达,分子生物学研究方法,绝对定量可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度。 （图5-11）,相对定量（两个样本中的基因表达水平进行比较 ） （图5-12）,分子生物学研究方法,五、基因组DNA文库构建,是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落，这个

18、群体就称为该生物基因组文库。,分子生物学研究方法,基因组DNA文库的类型 根据所选用的载体可以分为：质粒文库、噬菌体文库、粘粒文库、人工染色体文库（细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库）。,分子生物学研究方法,基因组DNA文库的质量标准,一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件： 重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力; 载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆; 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序; 克隆片段易于从载体分子上完整卸下; 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。,分子生物学研究方法,基因组DNA文库构建的程序, 载体DNA的制备； 基因组DNA的提

19、取； 基因组DNA的部分酶切、分离与回收； 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞； 重组克隆的挑选和保存。,分子生物学研究方法,分子生物学研究方法,第三节 RNA基本操作技术,一、总RNA的提取,液氮研磨组织、匀浆,加入Trizol试剂（异硫氰酸胍-苯酚）溶解细胞,氯仿 抽提,异丙醇 沉淀,溶 解,在变性条件下采用电泳方法对其进行检测,分子生物学研究方法,二、mRNA的纯化,分子生物学研究方法,分子生物学研究方法,分离mRNA的试剂盒,可应用Promega PolyAT tract mRNA分离系统分离poly(A)mRNA。将用生物素标识的寡聚(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁

20、球相连的抗生物素蛋白，用磁场吸附通过寡聚(dT)引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的mRNA。,分子生物学研究方法,三、 cDNA 的合成 可同时在反转录系统中加入Oligo（dT）12-18-mer及随机引物R6，以保证得到全长cDNA； 应选用活性较高的反转录酶（Reverse transcriptase）； 应选用甲基化dCTP(防止被限制性内切酶切割)； 应保证所获得双链cDNA的方向性(cDNA两端加上不同内切酶所识别的接头序列); 因为绝大多数大肠杆菌细胞都会切除带有5-methyl C的外源DNA，所以，应选用mcrA- ,mcrB-菌株。,分子生物学研究方法,分子生物学研究方法

21、,定向cDNA的合成及分子修饰,分子生物学研究方法,四、cDNA文库,将某种细胞的全部mRNA通过逆转录合成cDNA，与载体连接，然后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种群，称为cDNA 文库。cDNA文库具有组织细胞特异性。,构建cDNA文库，材料来自mRNA cDNA文库只含有mRNA的分子结构, 不含真核基因的间隔序列和调控区。,分子生物学研究方法,cDNA文库的特点：,出发材料是一定时空条件下的细胞总mRNA, 在转录水平上反映生物在特定发育时期、特定组织(或器官)在一定环境条件下的基因表达情况。 不同组织、细胞在不同时段的mRNA种类不同(即基因的表达谱不同)，同种生物的cDNA文库

22、有组织细胞的界定，如肝组织或胚胎组织。,分子生物学研究方法,分离纯化目的基因目的基因 + vector =重组DNA分子,分子生物学研究方法,噬菌粒的包装,含有cDNA插入片段的重组噬菌粒只有经过体外蛋白外壳包装反应，才能成为具有侵染和复制能力的成熟噬菌体。,分子生物学研究方法,分子生物学研究方法,五、基因文库的筛选,1、核酸杂交法,平板上的菌落,转移,硝酸纤维素膜,温育 碱变性 用蛋白酶K去除蛋白质,形成菌落DNA印迹,80烘烤滤膜,DNA固定,与探针杂交,检测杂交结果,分子生物学研究方法,2、PCR筛选法,1）、设计特异性引物； 2）、将文库保存在多孔培养板上，对每个孔进行PCR扩增； 3

23、）、对阳性孔进行稀释至次级孔，再对每个孔进行PCR扩增，直至鉴定出与目的基因对应的单克隆。,分子生物学研究方法,3、免疫筛选法,适用范围：表达文库,用某个基因产物的特异性抗体对重组克隆进行筛选。,分子生物学研究方法,分子生物学研究方法,第四节 SNP理论及应用,SNP，中文翻译为单核苷酸多态性，指基因组DNA序列中由于单个核苷酸的突变而引起的多态性。,分子生物学研究方法,单倍型：位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点被称作单倍型(haplotype)。,分子生物学研究方法,SNP的检测技术,1、基因芯片技术 概念：就是将大量探针分子固定于支持物上，根据碱基互补配对原理，与标记的样品分

24、子进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布进而获取样品中靶分子的数量和序列信息。,分子生物学研究方法,基因芯片的工作原理： 应用已知核酸序列作为靶基因与互补的探针核苷酸序列杂交，通过随后的信号检测进行定性与定量分析。,具体操作: 将许多特定的寡核苷酸片段或cDNA基因片段作为靶基因，有规律地排列固定于支持物上； 样品DNA/RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子或放射性同位素作为探针；,分子生物学研究方法,然后按碱基配对原理将两者进行杂交; 再通过荧光或同位素检测系统对芯片进行扫描，由计算机系统对每一探针上的信号作出比较和检测，从而得出所需要的信息。,分子生物学研究方法,2、Taq

25、man技术 在反应体系中加入2种不同荧光标记的探针，这两个探针分别与两个等位基因完全配对。 探针设计运用了荧光共振能量转移； Taq酶53外切酶的活性； 通过不同荧光值的变化，对基因型进行分型。,分子生物学研究方法,3、分子信标（Molecular Beacon Probe） 是一种呈环状结构的荧光标记的寡核苷酸，环状区与靶序列特异性结合，茎干区由58个碱基对组成，5端带有荧光发生基团，3端带有荧光猝灭基团。,分子生物学研究方法,分子信标（Molecular Beacon Probe）,分子生物学研究方法,4、焦磷酸测序法 是一种短片段焦磷酸测序技术，在测序引物的引导下，完成短片段（含SNP）

26、的测序，从而实现基因分型。 缺点：不能检测长片段，对于重复序列没有办法。,分子生物学研究方法,原理:,生成,分子生物学研究方法,原理 1、测序引物与PCR扩增的单链DNA模板相结合。然后将其与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶，以及底物APS和荧光素一起孵育。 2、4种dNTP之一被加入反应体系，如与模板配对，此dNTP与引物的末端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团（PPi）释放出来。而且释放出来的PPi的量与和模板结合的dNTP的量成正比。,分子生物学研究方法,3、ATP硫酸化酶在5-磷酰硫酸腺苷( adenosine 5 phosphosulfate, APS）存在的情况下催化

27、PPi形成ATP，ATP驱动萤光素酶介导的萤光素向氧化萤光素的转化，氧化萤光素发出与ATP量成正比的可见光信号。光信号由CCD摄像机检测并由相应的软件反应为峰。每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。,分子生物学研究方法,4、ATP和未掺入的dNTP由双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。 5、然后加入下一种dNTP。最终待测序列的顺序，即可从反应光强的信号峰中读出。,在体系中使用的是dATPS 而非dATP，因为dATPS不是荧光素酶的底物，而且DNA聚合酶对dATPS的催化效率更高。,分子生物学研究方法,SNP的应用 1、人类基因单倍型图的绘制； 2、SNP与人类疾病易感基因的

28、相关性分析； 3、指导用药与药物设计。,分子生物学研究方法,第五节 基因克隆技术,分子生物学研究方法,一、RACE ( Rapid amplification of cDNA ends),主要通过PCR技术由已知的部分cDNA序列来得到完整的cDNA的5和3端，又被称为单边PCR (one sided PCR)和锚定PCR (anchored PCR)。,分子生物学研究方法,主要步骤：,1、获得高质量RNA; 2、去磷酸化作用；（带帽子结构的mRNA不受影响） 3、去掉mRNA的帽子结构，加特异性RNA接头并用RNA连接酶连接； 4、以特异性寡聚dT为引物，在反转录酶的作用下合成第一条cDNA

29、链，其包括寡聚接头的互补序列； 5、分别以第一条cDNA链为模板进行RACE反应。 6、纯化后的PCR产物克隆到载体进行序列分析。,分子生物学研究方法,Calf Intestinal Phosphatase (CIP) 牛小肠磷酸酶 Tobacco Acid Pyrophosphatase (TAP) 烟草酸性焦磷酸化酶,高质量RNA,去磷酸化,去掉mRNA的帽子结构,加特异性RNA接头,以特异性寡聚dT为引物，合成第一条cDNA链,分子生物学研究方法,二、应用cDNA差示分析法克隆基因,分子生物学研究方法,分子生物学研究方法,试验材料(Tester) 探针材料(Driver),酶切,试验材料

30、(Tester) 探针材料(Driver)标记,加上接头, 扩增,两者混匀,变性,复性,具有同源性的片段杂交,是非特异性基因,没杂交的，可能是特异性基因，经过这样2-3次循环，基本上可以把特异性基因分离出来,分子生物学研究方法,第六节 蛋白质组与蛋白质组学技术,双向电泳（two dimensional electrophoresis,2-DE)技术，是大多数蛋白质组研究中分离复杂蛋白质混合物的首选技术 。 将来自于全细胞、组织或生物体中所包含的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测和分析 。,一、双向电泳技术,分子生物学研究方法,2-DE包括等电聚焦（isoelectric focusing, I

31、EF）及SDS-PAGE两种电泳技术。该方法根据蛋白质的两个性质即等电点和分子量。,以两性电解质为介质的电泳体系，不同等电点蛋白会聚集在介质的不同区域（等电点）；,SDS-PAGE将不同分子量的蛋白质分离。,分子生物学研究方法,凝胶的图像处理和分析,典型流程 凝胶图像的扫描： 图像加工： 斑点检测和定量： 凝胶配比： 数据分析： 数据呈递和解释： 2-DE数据库的建立：,分子生物学研究方法,二、蛋白质免疫印迹实验,原理： 确保蛋白质解离为单个多肽亚基能与SDS结合； 通过分离胶的筛分作用，将蛋白质多肽按分子量的大小不同得到分离； 将蛋白质固定于膜上； 以抗体识别待检蛋白（抗原）。,固 定 物,分子生物学研究方法,典型的印迹实验包括五个步骤：, 蛋白样品的制备； 经过SDS-PAGE分离样品； 将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性，非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域； 用固定在膜上的蛋白质作为抗原，与固定的非标记