蛋白质组学与分析技术第四讲.ppt

1、蛋白质组学与分析技术（第四讲）,高效液相色谱、气相色谱、质谱 液质联仪 邱德文 中国农科院植物保护研究所 2007。3。28,蛋白质层析分离纯化技术,蛋白质薄层层析（硅胶板+层析缸） 蛋白质柱层析（葡聚糖、硅胶填料） 蛋白质分析制备仪,蛋白质分析制备仪,准备工作,考虑: 纯度水平 需要量 保持生物活性 有效和经济,蛋白质特性: 稳定性 - pH - 离子强度 - 温度 分子量 等电点,三步纯化策略,步骤,粗提,精细纯化,层析填料的 颗粒大小,中度纯化,粗提,目的 纯化粗样 快速浓缩 (减少体积) 和稳定样品 (去除蛋白酶) 最适用层析技术: 离子交换 / 疏水层析,分辩率,快速,回收率,载量,

2、中度纯化,目的 去除大部分杂质 最适用层析技术: 离子交换 / 疏水层析,HiLoad 离子交换和疏水层析预装柱,分辩率,快速,回收率,载量,中度纯化: 离子交换填料,Sepharose HP 34 m,Q & SP,150 cm/hr,小包装和预装柱,交联琼脂醣,SOURCE 30 m,Sepharose High Performance,SOURCE 30,Q & S,1 800 cm/hr,聚苯乙烯/二乙烯基苯,小包装,中度纯化:疏水层析填料,Sepharose HP 34 m,苯基,300 cm/hr,小包装和预装柱,回收率,载量,精细纯化,目的 达到最终纯度 (去除聚合物,结构变异物

3、) 最适用层析技术: 凝焦过滤/离子交换 / 疏水层析/反相层析,分辩率,速度,色谱、质谱分析技术及蛋白质组学,色谱发展的历史,1906年:俄国植物学家M.S.Tswett 从一根装有固定吸附剂柱子的顶端注入植物色素的试样溶液,后使一种溶剂流过柱子,这时各个组分以不同的速度在柱内移动.,1.高效液相色谱,色谱原理：,色谱是一个分离的过程，在不同组分在固定相和流动相中，利用吸附能力、分配系数、离子交换能力、亲和力或分子大小等性质的微小差别，经过连续的多次在两相间的质量交换，使不同组分得到分离。,高效液相色谱系统,高效液相色谱的仪器组成：,1.高效液相色谱泵 可做梯度（四元梯度，waters），灵

4、敏度高（MS泵，几个ul） 2.自动进样器 3.色谱柱、柱温箱 4.检测器 （紫外检测器PDA，荧光检测器，示差检测器） 5.组分收集器（无）,卓有成效的工作方法,1 首先估价样品与分离目的（切不可低估此步的重要性） 2设计开始的分离条件，使之有可能在一两次实验中，便可能得到有希望的色谱图。 3 预测可能发生的问题，当问题出现时，能用已知的办法解决。,卓有成效的工作方法,4 有限考虑试用最有希望的、能控制的分离方法。 5 应对每次实验进行设计，能提供有用信息。 6 HPLC的目的是分离，而不必使所需谱峰“过渡分离”。,样品的性质和预处理,可直接进样的样品溶液 需稀释缓冲pH或添加另一液体的溶液

5、 能在流动相中溶解的固体 含有干扰物质或“损柱剂”而必须在进样前 将其去除的溶液 含有不容性赋性剂的混合物（动植物组织，高交联度聚合物、干性黏合剂） 绝大多数样品需经称重或稀释后进样，一般使最终样品液与流动相的成分尽量相近。,分离的基础：流动相的作用,要分离好的好，有两条途径：一是谱带窄，即柱效高；再就是谱带间距离大。 Rs=(t2-t1)/(1/2(w1+w2) t1，t2 为二相邻谱带间的保留时间，w1和w2为它们基线处的峰宽。Rs为其分离度。Rs1.5时 为完全分离。,当峰发生重叠时，难以准确测量到基线处的峰宽，更的办法好是用半高处的相应峰宽1和2： Rs= 1.18(t2-t1)/ (

6、1+2) Rs1.25在一般情况下，能达到99的分离度。 新柱的起始色谱图的Rs值越大，意味着该柱用此法时间越长。 Rs1.0时 定量分析一般精密度较差。,分离度与溶剂强度的关系,Rs=(1/4)(-1)N0.5k/(1+k) k代表了溶剂强度；为分离因子；N为理论塔板数。 溶剂强度的增大，Rs增大，满意的范围1 k20 在反相HPLC中溶剂强度会随着水/有机流动相中的有机相增加而增加。,柱类型与温度选择性的关系,柱类型不同，选择性业不一样，这与键和相有关。 温度的选择性，温度的变化会影响分离度，因为理解的程度与温度有关。,色谱柱与塔板数的关系,一般塔板数越大，分离度越好 合格的HPLC的塔板

7、数，一般不应低于标准值的80，否则为不合格。,色谱柱条件,流速适中，过高会降低塔板数。 当流动相粘度增加时，塔板数会降低， 对于反相体系，水的粘度较高意味着在高温时操作有利于最大限度的增大塔板数，在50度时较好。,其他因素,工作压力：低于150bar 操作时间：应尽可能短 峰高：只要检测灵敏度有限，需要窄而高的峰 溶剂应用：对日常工作、大量实验，每次进样少消耗流动相为好,色谱柱问题与解决办法,保留值与分离度的重现性 1选柱时，应考虑其化学性质 2在流动相中用缓冲剂，以除去化学的或硅羟基效应，尽量减少谱峰拖尾。 3保证温度、流速、和压力、溶剂成分恒定 4脱气 5保证上样不超载 110ug/mg填

8、料。 6使用同一批生产批号的材料,谱峰拖尾,柱坏 污物在柱进口处堆积 样品超载 样品溶剂不合适 化学或次级保留效应 缓冲不足 重金属污染,系统方法的建立,1检测条件的选择 2梯度洗脱进行首次实验 3优化流动相的选择性 提高分离度有三种方法： 1 提高塔板数 2 改变有机相比例，以改变谱峰间距 3 更换流动相溶剂，以改变谱峰间距,梯度洗脱优点,一次初始的梯度操作通常足以判断出大约正确的溶剂强度的流动相，使样品充分分离，通过分析谱峰，简化分确定离条件的步骤 建议用乙腈/水作流动相进行首次分离 乙腈操作压力低，溶剂强度高，检测波长宽：可在185205nm检测 其他有机溶剂：甲醇，丙醇，异丙醇，四氢呋

9、喃,优化反相HPLC步骤,1选择标准梯度条件进行首次实验 乙腈/水510025min,2ml/min或 乙腈/水510050min,1ml/min 2 调整梯度范围，尽可能减少色谱图开始和结束时的时间浪费,3 如果色谱峰复杂，分离较差： 延长梯度时间 加长柱长 使用细粒度的柱 降低流速以提高塔板数 4 一旦色谱图中能容纳所用峰，改变流 速以调整峰间距 5 需要进一步改变谱峰间距，改变有机溶剂,重现性好的分离,色谱平衡 通常情况下，柱子用1520柱体积的起始流动相充分冲洗后方可达到柱平衡。柱再生所需时间通常约等于梯度时间。 基线问题 等梯度HPLC,保证柱寿命和性能的步骤,1 选择好填充柱 2

10、减小压力波动，避免冲撞击 3 用保护柱和在线过滤片 4 经常用强溶剂冲洗柱子：反相用1:1的异丙醇/氯仿，正相用甲醇 5 样品预处理，尽量减少无谓的强滞留成分和微粒 6 用较柔和的pH值37 ；防止键和相的流失 7 储存时冲洗掉盐缓冲液，以纯乙腈保存柱， 避免高浓度的水和醇类,液相色谱柱及分离机理的关系,从色谱方法上分 正相 / 反相 离子交换 分子体积排除 亲合 疏水回受,从柱子类型上分 分配 / 吸附 离子交换 凝胶 亲合,吸附色谱的原理,随着样品在固定相上的吸附能力由大到小 在色谱柱上的保留由长到短,吸附色谱概述,分离基于样品的极性差异。 洗脱次序一般为正相，即：极性低的先被洗脱 常用的

11、流动相 非极性有机溶剂，如己烷 乙酸等为添加剂 常用固定相 硅胶、氧化铝、羟基磷灰石等。,分配色谱的分离机理,分配色谱概述,反相色谱的主要类型，基于分子的极性分离 洗脱次序：一般为反相，即极性高的先被洗脱 常用的流动相： 有机溶剂如甲醇、乙腈，水 应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法 常用固定相： 碳十八、碳八、胺基等基团 反相色谱固定相多为键合相?,键合相色谱柱,以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上，作为固定相。 优点 固定相稳定，不易流失 应用广泛，可使用多种溶剂 消除硅羟基的不良影响 缺点 pH值不能小于3 同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同,凝胶色谱概述,凝

12、胶渗透（GPC）、凝胶过滤（GFC） 分离基于分子在溶液中的体积大小 洗脱次序：大分子先被洗脱 流动相不参与分离，只起溶剂作用 分离效率低 色谱行为容易预测,离子交换树脂的分离机理,离子交换色谱概述,适用于离子型化合物的分离 分离基于离子的带电特性 洗脱次序受多种因素的影响 填料（离子交换树脂）的种类阴/阳，强/弱，交换基团 样品分子特性 盐的种类、浓度 温度及pH值 有机溶剂,色谱柱化学及外形结构的关系,高效液相色谱主要特点及应用：,1.分离制备： 与柱子的进样量相关，（2504.6,10ul) 自动组分收集器 （常压或者低压及专门的蛋白质纯化系统用于制备） 2.定性分析： 高效液相色谱作为

13、质谱的进样系统，将分离的组分注入质谱，进行检测。 3.定量检测： 需要有标样，按照稀释的浓度梯度，作出浓度与峰面积关系的标准曲线。后测定未知样品。,色谱实验的设计：第一步干什么?,想办法得到各种信息 向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法 查文献，如CA(化学文摘) 仪器制造商的文献，如Waters 对色谱柱有足够的了解 掌握分离机理，自己开发方法 充分了解您自己的样品,分析时要了解哪方面的情况？,灵敏度的要求有多高? 样品的本底是否很复杂? 有多少组份要分析? 对分析的精确度、准确度等有多高要求? 是否因是日常检验，而要求方法容易使用?,分离时要了解哪方面的情况？,要分离（即制

14、备）的样品量有多大? 要分离的组份在样品中的含量很高? 还是微量? 是否需要保持生物活性? 对分离产物纯度的要求有多高? 纯度或活性的鉴定如何完成?,高效液相色谱分离分析的实验设计：,1.色谱柱的选择 根据实验目的(分析or分离纯化) 选择合适的色谱柱类型 2.选择合适的检测器(苯与糖类的例子) 3.合适的样品前处理(一定要根据色谱柱的适应范围) 4.根据样品的性质选择合适的流动相,并试验选择不同的浓度梯度.,高效液相色谱的主要参数设置:,1.最大压力(低于柱子的最高要求) 2.进样量(视色谱柱而定) 3.流动相选择及配比,梯度的设定(梯度设定的技巧和原则) 4.运行时间 5.检测器的检测参数

15、的设置. 6.设置柱子平衡和冲洗的时间.,液相色谱对流动相的要求,除色谱柱对流动相对的要求外，还有 与检测器匹配 脱气 避免卤素离子（不锈钢系统） 溶剂的粘度 细菌的生长,样品的预处理,样品预处理的目的 除去微粒 减少干扰杂质 浓缩微量的组份 提高检测的灵敏度及选择性 改善分离的效果 有利于色谱柱及仪器的保护,样品的预处理重要性,占样品分析时间的比例 样品预处理所用时间远大于色谱分离的时间 占分析的消耗总成本最大 消耗大量的溶剂及其他化学品 实验的重复性及准确性最差的环节 影响实验结果好坏的最重要因素 是决定性的步骤,样品预处理常用的方法,高速离心 过滤、超滤 选择性沉淀 衍生反应 液-固萃取

16、 / 液-液萃取 Sep-Pak样品处理小柱 其他,样品衍生,提高检测的灵敏度 增加紫外基团以增强紫外检测的灵敏度 增加荧光基团使样品用高灵敏度荧光检测器 改变分离的选择性 改变组份的基团，如： 变离子型化合物为非离子型，用反相方法分离 典型的例子 氨基酸分析,样品衍生氨基酸分析,浓缩样品,浓缩样品的方法 萃取/吹干 沉淀/再溶解 色谱法 液固抽提/Sep-Pak小柱,固相萃取（SPE）技术,固相萃取技术是基于同液相色谱同样技术开发的产品，分离复杂样品中的不同组份 固相萃取技术（SPE）的重要性 实验室中6080%的成本及工作量在样品制备上 加速样品的制备时间 降低样品前处理的成本 提高分析的

17、准确性及回收率 更容易自动化 减少样品处理步骤 降低对不稳定样品的影响 提高安全性,色谱峰定性,鉴别每个色谱峰 通过比较保留值(通常是保留时间)的方法，找到各色谱峰所对应的组份 大多数情况下用比较保留时间来定性 即所谓： 保留时间相同，可能是同样的组份 保留时间不同，肯定不是同样的组份,用保留时间定性,用“标样”的保留值定出被测组份的位置,进一步的确认,标准加入 同时用其他方法 其他色谱方法（改变机理，如：用不同的色谱柱） 其他检测器 PDA，光谱图比较、谱库检索 MS，质谱图解析、谱库检索 其他仪器方法,外标法定量,配制一系列已知浓度的标样,外标法定量（二）,实际色谱图,标准曲线,检测器的种

18、类,高效液相色谱在蛋白质研究中的应用,1.蛋白质的分离纯化,(活性问题,测序要求的rp-hplc条件) 2.氨基酸组成分析(氨基酸标样,N端测序) 3.蛋白质酶切肽端的分离,注入质谱后进行蛋白质组学的分析. 4.样品纯度的粗鉴定(可能存在共流出现象),高效液相层析,高效液相层析可进行各种分离，包括阴离子和阳离子交换，大小排阻和亲和层析，从复杂混合物中分离某中蛋白质组分,肽分离,把全部细胞或组织初提物消化成肽，然后进行肽混合物的MS分析，将非常不均一的蛋白质混合物转换成更容易分析的较均一的肽混合物,蛋白质消化技术,第一，蛋白质的质量越大，觉得误差值越大，蛋白质翻译后修饰使质量测定更为复杂 第二，MS对大分子蛋白质和疏水蛋白质很难进行质量测定 第三，完整蛋白质质量测定的灵敏度远低于肽质量测定和肽串联MS分析的灵敏度 目的：产生最适于MS分析片段（6-20个氨基酸的肽）,高效液相色谱的基本操作规程,高效液相色谱的基本操作规程 开机 1 根