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文档简介

1、EGFP基因在pET-28a载体内的克隆和表达,绿色荧光蛋白(green-fluorescent protein, GFP) 是从太平洋水母中分离出来的一种荧光蛋白质, 为238 氨基酸组成的单体, 分子量约为27kD。 其野生型(wild-type GFP)的吸收/激发峰在395 nm , 在475 nm 有一个次要峰，发射峰为508 nm。对细胞无毒，用于转基因表达的检测。,绿色荧光蛋白(GFP),GFP 的应用特点：,1、检测方便：不需要外加底物和辅助因子，用荧光显微镜甚至肉眼就可以观察到，且灵敏度高，对于单细胞水平的表达也可识别。 2、荧光稳定：GFP 对光漂白有较强的耐受性，能耐受长

2、时间的光照；在pH范围在7-12 之间都能正常发光；对高温、碱、离子除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶都有较强抗性。 3、无毒害：GFP 对生活的细胞基本无毒害,对目的基因的功能也没有影响,转化后细胞仍可连续传代。 4、具有共用性和通用性：首先表现在GFP 的表达几乎不受种属范围的限制，在微生物、植物、动物中都获得了成功的表达；其次是GFP 没有细胞种类和位置上的限制，在各个部位都可以表达发出荧光。 5、易于构建载体：由于GFP 分子量较小，仅为27-30kD，编码GFP的基因序列也很短，所以很方便地同其它序列一起构建多种质粒。 6、可进行活细胞定时定位观察。于得到突变体。,关于EGFP蛋白,pEGFP-N3质粒编码EGFP蛋白，它是野生型绿色荧光蛋白（wtGFP）经克隆技术改造而成的遗传突变体。它有两个氨基酸的替换，即 Phe264Leu 和 Ser265Thr。用485 nm光激发时，EGFP可以产生比wtGFP 强 35 倍的荧光。另外，EGFP具有红外转换激发光谱（red-shifted excitation spectra），而且能在哺乳动物细胞内得到高水平表达。,质粒pEGFP-N3图谱,表达载体pET-28a,pET表达体系是在大肠杆菌中克隆和表达融合蛋白常用的体系之一。 使用T7Lac启动子； BamHI下游存在转录终止信

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