MGB探针设计原则

1、整体原则首先，选择探针，并尽可能接近探针设计引物。选择的序列应尽量选择具有最小二次结构的放大片段。因为二次结构影响反应效率，阻碍酶扩增。如果不能先进行二次结构测试，避免二次结构，建议相应提高退火温度。放大长度不应超过400bp，理想的是在100-150bp内，放大片越短，获得有效的放大反应就越容易。短放大片段很容易保证分析的一致性。保持GC含量在20%和80%之间，GC丰富部位会发生非特异性反应，放大效率降低，在荧光染料分析中可能出现非特异性信号。为了确保效率和重复性，应避免重复的核苷酸序列，尤其是g(不能有4个连续g)徐璐配对测试引物和探针，以避免形成二聚体和发卡结构。引物设计原理序列选择应

2、该在基因的保留部分防止与引物本身或引物连续4个以上配对，并防止引物本身形成环销结构典型的引物18-24个核苷长度。引物需要足够的长度以确保序列的唯一性，并降低序列在无意序列位置存在的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。长序列可以与错误的配对序列杂交，特异性下降，速度比短序列杂交慢，产量减少。Tm值为55-65(因为60核酸外体酶活性最高)，GC含量为40%-60%底漆之间的TM差异不能超过2底漆的3 端避免使用底座a，底漆的3 端避免3个或3个以上连续相同的底座发生为了避免基因组扩增，引物设计最好横跨两个埃克森公司之间。Taqman探测技术要求碎片长度为50bp-150b

3、p引物末端(最后5个核苷酸)不能有2个g和c。探针设计原理探测位置尽可能接近上游引物探针长度必须在15-45bp(最好是20-30bp)之间，以确保耦合特异性探针的DNA折叠和二次结构检测Tm值为65 70c，通常为5 10c(至少5c)，GC含量为40%-70%探针的5 端应避免使用g球以外的。因为5G有淬火作用，切割也有淬火作用。在整个探针中，基本c的含量必须明显高于g的含量G，反应效率才会下降，因此必须选择其他配对链作为探针。为了确保引物探针的特异性，建议在blast中检查一次设计的序列，如果发现非特异性互补，则重新设计引物探针。Taqman MGB探针设计探针的5 端防止产生g，即使探

4、针水解成单个碱基，连接到报告组的g碱基也会浸泡组的荧光信号。Tm值必须在65 67之间。尽可能减少Taqman MGB探测，但探测长度小于13bp。尽量避免重复的碱基，尤其是g碱基要避免4个或4个以上g的重复。原则上，MGB探针只要有一个碱基突变就能检测到(MGB探针不产生荧光信号，不与目标片段杂交)。因此，在SNP检测时，为了检测湍流，Taqman MGB不与目的片段杂交，不产生荧光信号，探针目的片段生成荧光信号检测，并将探针的突变部位尽可能地放置在中三分之一处。注：探针的突变部位可以向3端移动，以满足上述要求的4个条件，但突变部位必须位于至少3端2个碱基之间的前端(即探针的最后2个碱基是绝

5、对保守)，以便进行SNP检查。相反，为了进行同类检查，寻找保守片段区域，探针不得有突变部位。即使探针只有13个BP，探针也不是完全保守的。有几个突变，突变部位也要接近探针的5 端。这样即使是突变，探针也能与目的片段杂交，产生荧光信号。另一种方法是设计简单探针，以便检测突变。步骤3:找到可靠的公司合成底漆和探针。一般来说，底漆的合成很熟悉，价格也便宜(特别是两年来便宜得多)。另一方面，探针比较贵，一般以1000 5000元(合成要求价格不同)合成Taqman探针。只是标记价格，系列合成基本上类似于引物合成价格。步骤4，5，6:一般定量PCR反应系统与一般PCR反应系统没有太大差异。只是添加Taqman探针。其他差异是逐步方法。这里需要注意的是：扩增酶是热启动酶的最佳选择如果需要优化引物和探针的浓度，建议从50nM开始，在50n m-900 nm之间进行优化，一般为200nM(探针需要保留被光)。同样的Mg和酶量也要优化，酶的推荐反应浓度为1.25-1.5U(50ul)由于DNA模板添加量通常小于100 ng，不同种类DNA模板中目标基因的副本数不同，因此如果需要，可以使用渐变来确定最佳DNA模板添加量。如果