流式细胞分析分选原理.ppt

1、流式细胞仪工作原理,流式细胞术的原理,流式细胞术（FCM）是一种能对单个细胞、分子和生物颗粒（微生物）进行多参数快速检测的新型分析和分选技术。近几年随着多种单克隆抗体的成功制备和多种荧光素的应用。FCM逐步运用于对疾病诊断和治疗监测的临床检验常规工作。,流式细胞仪与显微镜,基本原理,流路 流动室 鞘液SHEATH 样本流SAMPLE 单细胞悬液5*1051*106个/ml 光路 光源 检测信号 光电倍增管PMT HV 电路 放大电路HV及GAIN 增益 A/D转换 统计：计算机,流式细胞仪,光路,流路,电子,软件,流路,光路,电路/电子,软件,流 路,单细胞悬液 大多数仪器是在50-300 m

2、 大小的孔径中,将细胞悬液注射进入鞘液中 这一过程,成为流体动力学聚焦,FLOW CELL,流路,光路,电路/电子,软件,光 路,光源 检测信号 散射光信号 FS: 前向角散射光 SS: 侧向角散射光(90度散射光) 荧光信号 荧光染料 光学滤片 颜色补偿,光 路,光源 与通过的细胞聚焦在同一点上 激光 空冷 488nm blue, 633nm red, 325nm UV, 514nm green, 水冷 Innova300系列Innova70系列 固态,检测信号,散射光信号前向散射光(FS),FS-Forward (Angel Light) Scatter 在激光束正前方的检测器, 为前向散

3、射光检测器 FS的强度与细胞或其他颗粒的大小, 形状及 optical homogeneity 有关 FS用于检测细胞或其他粒子的表面属性 如:大小,前向散射光,散射光信号 侧向散射光,SS-Side (Angel Light) Scatter 与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器, 也称为90度散射光检测器 SS的强度与细胞或其他颗粒的大小, 形状及 optical homogeneity 有关 SS用于检测细胞内部结构 如:胞浆内颗粒多少, 核质比,侧向散射光,90 Degree Scatter,0,200,400,600,800,1000,8,15,20,30,40,50,100,200

4、,1000,Lymphocytes,Monocytes,Neutrophils,Side Scatter Projection,Light Scatter Gating,Scale,光路-荧光信号,每种荧光染料均有特定的激发波长, 并激发后会有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长. 利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)这些光学信号,荧光染料的特性,激发波长(EXCITING) 发射波长(EMISSION),Fluorescence emitted by each fluorochrome is usually detected in a unique fluorescence c

5、hannel. The specificity of detection is controlled by the wavelength selectivity of optical filters and mirrors.,Absorption spectrum: Range over which a fluorescence compound may be excited,Emission spectrum: Range of emitted wavelengths for a particular compound,5 Color Single Laser (488nm)FITC/PE/

6、ECD/PC5/PC7,4 Color Single Laser (488nm)FITC/PE/ECD/PC5,常用荧光染料的特性,荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途 颜色 FITC 488 525 免疫荧光 绿色 PE(RD1) 488 575 免疫荧光 橙色 ECD 488 620 免疫荧光 橙红 PeCy5 488 675 免疫荧光 红 PI 488 620 DNA染色 橙红 PECy7 488 755 免疫荧光 深红 PerCP 488 670 APC 633 670,光路 - 滤片特性,当以 45o 角放置滤片时,该滤片可以通过一定波长的光,同时也可以阻断并折射该波

7、长以下的光 这种方式的滤片称为二向色性滤片( dichroic filter),标准带通滤片 band pass,光源,通过的光谱,630/30 nm BP,615-645 nm light,Source light,Passed light,Certain colors absorbed,Absorbance filter,488 DL,488 BK,550 DL,525 BP,600 DL,575 BP,640 DL,620 BP,675 BP,Unique 4-Color Single Laser Design,PC7,With Thanks to Dr. Frank Schnieder

8、s Gentherapie Gruppe Abteilung Molekulare Zellbiologie Institut fr Medizinische Biochemie und Molekularbiologie Universittsklinikum Hamburg-Eppendorf,EGFP, EYFP and 7-AAD With EPICS XLTM and EXPO32TM ADC-Software,HEK293 Human Embryonal Kidney Cells 293,Filter Set BP 510LAF21 BP 550LAF30 Dichroic Mir

9、ror 525DRLP,Cell Viability with 7-AAD,HEK293-cells with EYFP Transfection,HEK293-cells with EGFP Transfection,Mixture of EGFP- and EYFP-transfected HEK293-Cells EGFP . Enhanced Green Fluorescent Protein (Ex 488; Em 507 nm) EYFP . Enhanced Yellow Fluorescent Protein (Ex 513; Em 527 nm) 7-AAD .7-Amino

10、actinomycin (Viability Stain ; Ex 546; Em 647 nm),颜色补偿,减法颜色补偿,减法补偿 去除叠加信号,在使用双色以上时会产生减得过多的错误 BD FACSCalibur 补偿试剂,全矩阵颜色补偿,全矩阵 在每个PMT上对于每一个荧光计算 “叠加荧光素” 的比率 通过矩阵去除或加上信号 EPICS XL Cytomics FC500 Gallios/Navios,CD45-ECD,流路,光路,电路/电子,软件,电路及电子系统-光电倍增管,Photomultiplier tube (PMT) 将光学信号转变为电脉冲(数字数据)信号,不同的脉冲信号被转换

11、成数字通道(CHANNEL)的过程,单参数直方图,流路,光路,电路/电子,软件,软件,基于Windows 平台 软件界面简单，易学易用 目前流式获取和分析最友好的软件包，涵盖所有数据和图形处理功能 易于与医院内LIS系统相连 直观拖拽方式调节电压、补偿，支持时时/自动/脱机补偿 支持多文件分析报告，内置FlowPage功能，方便中文临床报告的生成和输出 PRISM浓缩柱形图功能便于结果统计，兼容Office，支持PDF 内置质控功能,Quickset直观的电压调节,QuickComp直观的补偿调节,补偿前,补偿后,PRISM浓缩柱形图,一张图上显示多达1024个表型组合结果（十色分析，210分析组合） 将实验所分析的所有细胞数据结果简单地浓缩在一张直方图上 能直接读出各种阴性或阳性组合的结果