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1、Membrane Biophysics,尹长城 北京大学医学部生物物理学系,2. 膜蛋白的拓扑学,为什么要了解膜蛋白的拓扑学？,蛋白质的结构决定功能 膜蛋白的功能具有跨膜方向性 了解膜蛋白的功能必须了解其膜拓扑学,什么是膜蛋白拓扑学？ (membrane protein topology),1. 蛋白质序列中的跨膜片断 那些部位插膜 2. 蛋白质在膜上的取向 那些部分位于细胞膜的内侧，那些部分位于细胞膜的外侧,2.1 膜蛋白拓扑取向的基本原理,2.1.1 疏水性原则 脂双层的碳氢链区是高度疏水的区域 蛋白质的跨膜区域必定是高度疏水区域 蛋白质一般以-螺旋形式跨膜 跨膜-螺旋的长度一般为20个氨

2、基酸 以20个氨基酸为单位，计算蛋白质序列的疏水性 蛋白质中疏水性大的序列，即为可能的跨膜区域,2.1 膜蛋白拓扑取向的基本原理,2.1.2 正电荷氨基酸向内原则 对大量已知结构的膜蛋白统计分析表明，荷正电的氨基酸倾向于位于胞质一侧 线粒体、叶绿体中荷正电的氨基酸则位于基质一侧 此规则只适用于长度小于60个氨基酸的片断 随片断长度的增加，正电荷氨基酸位于内侧的几率降低,正电荷氨基酸在质膜内外的分布,肽段中正电荷所占比例 与loop长度的关系,质膜内,质膜外,含电荷氨基酸肽段 长度几率分布,2.2 膜蛋白拓扑学的研究方法,2.2.1 蛋白质疏水性分析 1. 以10-20个连续的氨基酸为计算单位，

3、计算该肽段疏水指标之和（eg. 1-10, 2-11, 3-12, etc.）作为该肽段的疏水指数（hydropathy index） 2. 以疏水指数对氨基酸序号作图 3. 具有高的疏水指数的一个20个氨基酸的肽段即为可能的跨膜螺旋片断,疏水性的定量计算,Go越正（0)，表示氨基酸越难从有机相转移至水相，即越疏水 Go越负(0)，表示氨基酸越易从有机相转移至水相，即越亲水 Go用来代表氨基酸的疏水性,氨基酸的疏水性,疏水性氨基酸：Phe, Met, Ile, Leu, Val 亲水性氨基酸：Arg, Asp, Lys, Glu, Asn, Gln, His,细菌视紫红质的结构,预测,实测,2

4、.2 膜蛋白拓扑学的研究方法,2.2.2 酶解法 蛋白质包埋在脂双层中可抵抗水解酶的作用 利用水解法可判断蛋白质暴露于膜外的部分 选择水解酶的作用方式可判断蛋白的取向 外侧加水解酶：蛋白向外部分发生水解 内侧加水解酶：蛋白向内部分发生水解,2.2 膜蛋白拓扑学的研究方法,2.2.2 酶解法 制备蛋白取向一致的膜囊泡 加入蛋白水解酶（如胰蛋白酶） 加入酶抑制剂终止反应 SDS-PAGE 分析,酶解法,2.2 膜蛋白拓扑学的研究方法,2.2.2 酶解法 蛋白酶抑制剂必须有效 保证有限酶解，不是完全酶解 应用多种水解酶，互相印证结果 阴性结果说明 蛋白质没有膜外部分 或 膜外部分无水解酶切位点 检测

5、方法： 如所研究蛋白占大部分，可直接分析 如所研究蛋白占少部分，须应用抗体或其它标记方法分析,2.2 膜蛋白拓扑学的研究方法,2.2.3 同位素标记法 制备蛋白取向一致的膜囊泡 125I标记 SDS-PAGE 放射自显影分析 选择标记方式可判断蛋白的取向 外侧标记：蛋白向外部分被标记 内侧标记：蛋白向内部分被标记,同位素标记法,2.2 膜蛋白拓扑学的研究方法,2.2.3 免疫学方法 制备蛋白取向一致的膜囊泡 加入胶体金标记的针对特定肽段的单克隆抗体 电子显微镜观察 分析,2.2 膜蛋白拓扑学的研究方法,2.2.4 化学标识法 极性试剂 不能插膜：标记蛋白质膜外部分 非极性试剂 可以插膜：标记蛋

6、白质膜内部分 将化学标识物事先用放射性同位素标记，反应后用放射自显影检测,2.2 膜蛋白拓扑学的研究方法,2.2.4 化学标识法 制备蛋白取向一致的膜囊泡 加入同位素标记的识别特定位点的化学标识试剂 SDS-PAGE 放射自显影,2.2 膜蛋白拓扑学的研究方法,2.2.5 特殊部位定位法 糖基化位点：位于细胞膜的外侧 磷酸化位点：位于细胞质一侧 通过分析蛋白质上的这些位点即可推知相应修饰位点的拓扑取向,2.2 膜蛋白拓扑学的研究方法,2.2.6 融合蛋白法 原理： 特定蛋白质在特定的细胞器内方有活性 将待定蛋白基因与报告蛋白基因融合 将融合基因在适当宿主细胞中表达 测定报告蛋白的定位 优点：原

7、位细胞器定位 缺点： 融合蛋白可能破坏原蛋白的拓扑取向 融合蛋白可能破坏原蛋白的构象及生化活性,2.3 影响膜蛋白拓扑取向的因素,1. 信号肽 蛋白质刚合成时N端带一条短肽-信号肽， 长度为15-25氨基酸，带正电荷 信号肽的功能 阻止新生肽链过早折叠，以利于转运 与膜上特异受体结合，实现选择性跨膜转运 正电荷使得信号肽不能跨膜转运，导致蛋白选择信号肽朝内的拓扑取向 （图）,2.3 影响膜蛋白拓扑取向的因素,2. 跨膜电位 Anderson等构建了Lep蛋白的突变体，在其N端引入不同数量的正电荷 在跨膜电位存在时，蛋白质的N端朝内 当膜电位消失时，蛋白质的N端朝外 正电朝内依赖于膜电位（图） 细胞的电位内负外正，正电向内能量上有利,2.3 影响膜蛋白拓扑取向的因素,3. 膜上负电荷磷脂的比例 Kruijff等构建了E.