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文档简介

1、实验十三 DNA含量的测定,核酸的定量和纯度测定,紫外分光光度法：此法要求核酸纯度很高。1个Abs相当于50ug/ml双螺旋DNA。除了定量测定以外还可进行核酸纯度的检测，A260/A280比值，纯的DNA为1.8，RNA为2.0，样品中含有蛋白质和苯酚时， A260/A280 比值降低。 定糖法（DNA糖部分为脱氧核糖，RNA糖部分为核糖，分别可以进行二苯胺显色法和地衣酚显色法） 定磷法（核酸的磷酸部分）,二苯胺显色法原理,DNA在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸，而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成-羟基-酮基戊糖，与二苯胺试剂反应生

2、成蓝色物质，在595nm波长处有最大吸收。DNA在40400g范围内，光吸收与DNA的浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。,实验方法,A260测定:以H2O作为空白，取上清测A260值后确定稀释倍数，使A260值在2.0左右（DNA此时的浓度约为100ug/ml。由于二苯胺法的测定范围是40-400ug/mlDNA，所以DNA浓度如果太小会影响测定结果） A280测定： A260/A280比值计算。纯的DNA为1.8，RNA为2.0。如果样品中混有RNA，则比值大于1.8；如果样品中混有蛋白质，则比值小于1.8。 所用的DNA溶液为前面提取后溶解的DNA样品。,DNA标准曲线的制作和样品测定,注： 待测溶液中的DNA含量应调整至标准曲线的可读范围内。 样品1和样品2为不同稀释倍数的DNA溶液。,按上表加完各试剂后，充分混匀。于60水浴中保温1h，冷却后于595nm波长处以0管为空白调零，测定各管光密度（OD595nm）。以DNA的含量为横坐标，光密度（吸收值）为纵坐标，绘制标准曲线。,DNA含量计算,DNA含量计算：以样品的光密度，根据标准曲线计算出相对应DNA含量。并同紫外法测定的值进行比较。 附 注：二苯胺试剂具有腐蚀性，且二苯胺反应产生的蓝色不易褪色，操作中应防止洒出，比色时，比色杯外面一定要擦干净。,思考题,简述二苯胺法测定DNA含量的原理。

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