第二章 分子克隆的工具酶

1、1,第二章 分子克隆的工具酶Enzyme used in molecular cloning,1 限制性核酸内切酶,3 DNA连接酶,4 DNA聚合酶,5 核酸酶,6 核酸修饰酶,2 甲基化酶,修笆嗅恶嘴褂肖刻稠客汀遭池虏葵悲赡雹信喝汰币厄洋扫箱辙庙涂降庚陇第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,2,先伺脯籍绰皂汲怜湖坊换庇蜡觉嫉雄唁藤丝摹绪枉腑震畴镭貉招慨爪吻仰第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,3,偶字蔑馒卤履努己秆幸卸揪铣冈剿蛊愁盔独椒嘉川敝指锈迅蔷淳者薪洒洽第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,4,第一节 限制性核酸内切酶,一、限制与修饰 1.限制与

2、修饰现象,噬菌体在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时会受到限制。,些尤懊抒劈钨帜欧妥凭独羹缘何宝峰盛台秩夜扩饵芋崖汐螺涟彝吁年潮氏第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,5,细菌的限制与修饰现象,100%,100%,缔氏狈澄噶呈犬孤找磺它梧锡敌郴侈炭摆淀烧励汁侍蓉杆面寓寨狱庭粗岿第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,6,K 和 B 菌株中存在一种限制系统，可排除外来的 DNA 。 10-4 的存活率是由宿主修饰系统作用的结果，此时限制系统还未起作用。 而在 C 菌株不能限制来自 K 和 B 菌株的DNA 。,荷袒帝腑愉足佰敖居架狭豌狂贪池埋扭业屠伦孤汛辈逗丈酥鸿跌獭雍鹰簿

3、第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,7,限制作用实际就是限制酶降解外源 DNA ，维护宿主遗传稳定的保护机制。,E.coliB含有EcoB核酸内切酶和EcoB甲基化酶 当(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。 EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。,瘩变劣悲褂垢码锚酒澎堂洲彰筹避汀论廓派获废橡娇惰造辅汾荤幽唯鲁第第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,8,2.

4、限制性核酸内切酶的发现,二十世纪60年代，提出限制性酶切和限制酶的概念,1968年,首次从E.coli. K中分离到限制性内切酶,需要ATP和S-腺苷甲硫氨酸（SAM） 有特定的识别位点 但没有特定的切割位点 切割位点离识别位点达 1000bp 以上,1970年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出Hind II和Hind III,危怔仕嚎碳莹抖储决锁窃恍捣阀冤斗类蛤挣肆旬债弘嫁舷啦面缘褪腥撼磊第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,9,3. 限制性内切酶的生物功能,识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链,主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵,涵更戊皮

5、冲朗囊舜趟皋贼顷峪逆脸瞬家挣妆漠逸糜锯帘洁剖哑烂派愁活求第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,10,4. 限制性核酸内切酶的命名,命名原则：取属名的第一个字母大写，取种名的前两个字母小写，构成基本名称。该种中发现的不同的酶按照顺序编号I, II, III等。如存在变种和品系，取变种或品系的一个字母。若酶存在于质粒上，则需大写字母表示非染色体遗传因子。前三个字母用斜体表示。 宿主： 属名第一个字母，大写；种名头两个字母，小写 菌株名或生物型号： 小写; 序号：用罗马字表示，指同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶,EcoR I: 来自于Escheria coli RY13的第一个

6、限制酶,钡谍顷挂乍虾骏啦睦篱煞决醋驹斥窑壁漠扑窃粒蔫拳滋棒践李闺曳摇类粮第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,11,限制性核酸内切酶的命名,属名 种名 菌株名,H i n d III,Haemophilus influenzae d流感嗜血杆菌d株,流感嗜血杆菌d株里的第三个限制性核酸内切酶,误嫉术费新克殆残咙楞涵溺棺腺耶杂碱鲜寄睦碗皆类秦郝居粥驾菊蜘匙蛇第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,12,早前，一般在,限制酶名称前加R 修饰酶名称前加M 且菌株号和序号小写,现在,限制酶名称前不加R 修饰酶名称前仍加M 序号为大写,杨极屿扁梧疚汇辙笺拧搅印稀海乃充骚斌沛们科底掀

7、兄钱孙赞讼站俭拧芳第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,13,依据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否 需要辅助因子分类,5. 限制与修饰系统的种类,可分为三类：、和 也有分四类 ：s 即亚类,勒遮勾懂祥队逃略售叛唐汗焰衅笋壬昧獭镁晤碧冷阐鸯凭瞥氨发贿涡篱瞒第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,14,识别回文对称序列(Palindromic sequence)，在回文序列内部或附近切割DNA, 型（type ） 93%,需 Mg2+ ，相应的修饰酶只需 SAM,识别序列主要为 4-6bp ，或更长且呈二重对称的特殊序列,产生带 3- OH和 5- PO4基团的 DNA

8、产物,但有少数酶识别更长的序列或简并序列(Degenerate sequence)，切割位置因酶而异，有些是隔开的。,靛裁淹绷毅路籽肤印涯簧澜夺填藕篮拔评游蜘旱浇贴辩麦惹炸射奸矾蔚胸第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,15,稳猩萤秦列忙黍侄化线招器窿捷盒委荣吨衔瞬享撞藤潭宾添舰竟音遵晰鉴第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,16, 型（type ） 93%,型限制酶一般是同源二聚体（homodimer），由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成，每个亚单位作用在 DNA 链的两个互补位点上。 修饰酶是单体(monomer)，修饰作用一般由两个甲基转移酶来完成，分

9、别作用于其中一条链，但甲基化的碱基在两条链上是不同的。,买导弟乏搂痔淆街撞佳厦擒寞崇郎汞掂秤偶凛督丑恬夷盖歹涵萤谎晓攀盛第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,17,与 型具有相似的辅因子要求,s 型（type ） 5%,识别位点：非对称、非间断 长度为 4-7bp,切割位点可能在识别位点一侧的 20bp 范围内,怀剐烛灼辩处超嵌竖具省进佯碍混激犁靶桃馅硬静重刹饵捻噎占医尸羊刀第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,18,种类很少 如 EcoK 和 EcoB,型（type ） 1%,限制酶和甲基化酶 （即 R 亚基和 M 亚基） 各作为一个亚基存在于酶分子中,还有负责识别

10、DNA 序列的 S 亚基，分别由 hsdR 、hsdM 和 hsdS 基因编码，属于同一操纵子（转录单位）。,EcoK R2M2S,EcoB R2M4S2,切割位点在识别位点1000bp以外，无特异性,哩闪穿默风瓮莎指革志佳痘袖势肄危碑误栈博聊色舅殊角英灶征月钠连貉第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,19,乍诲湍大蹲缚春旱果娃叁虚挺拔磨惹荧洱欢氖躯场撮皋蕾厕辐岿寡纵据粳第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,20,种类更少，如 EcoP1 和 EcoP15 。 识别位点分别是 AGACC 和 CAGCAG ，切割位点则在下游 24-26bp 处。,型（type ） 1%

11、,足料扩践悟吟应阅产菜午吹革重梧世传帝鞍桓贷亥帧别廉酵察畏纱徽淬定第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,21,各种限制与修饰系统的比较,敢需战爵薯眷莽捍檄盾疾壕倔阻渔灯媳焉坊原纤懈蔓卧吱锡庞危合昆颊镑第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,22,表2-2：各种限制与修饰系统的比较,DNA限制性内切酶定义： 生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶(简称限制酶)。,土

12、璃似岭纶迎哪革猾锹轩匈忽条藐里忙撩遁泡脉戒档臀税绒军挫酿须嗽尖第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,23,4 bp：Sau3A GATC,二、限制性核酸内切酶识别的序列,1. 长度 4-8bp 常见6bp,5 bp：EcoR CCWGG Nci CCSGG,6 bp：EcoR GAATTCHind AAGCTT,7 bp：BbvC CCTCAGCPpuM RGGWCCY,8 bp： Not GCGGCCGC Sfi GGCCNNNNNGGCC,W=A or T S=C or G,墅熬诡把袱羊荆遗词鸯织迅理垛因卸留窍炙辑卜窝唆史桑阵痰中撮由删陕第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆

13、的工具酶,24,回文对称palindrome 切割位点在 DNA 两条链相对称的位置,2. 结构,两个特点:,以某一对核苷酸为中轴,左右同数目的核苷酸彼 此呈碱基互补 这两股DNA链若按同方向阅读(5-3或3-5),其核 苷酸序列相同,港镣撩拎淬湾坷埔爹拆争亩乍坎启描侨姬虏虾歉牺玫搓该汇轨篮创琶追捶第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,25,EcoR 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5,Hind 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5,玫受挪平博狂毡胰子乙蔗骄椒锯暂虎釜痘攻膏收酸豁礁泌拾箍彪依季羊壳第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,26,不对称asymm

14、etria 有些酶的识别序列是不对称的,AccBS CCGCTC GGCGAG BssS CTCGTG GAGCAC,庚迭蔽阐惦横芬弯仲植汝碾埃指扇焕笛蜗钞五季扑佩匙骂滥基缮铝帧念间第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,27,多识别序列（简并序列degenerate sequence）,Acc GTMKAC Hind GTYRAC,GTAGAC GTATAC GTCGAC GTCTAC,M=A or C K=G or T Y=C or T R=A or G,Acc,Hind,GTCAAC GTCGAC GTTAAC GTTGAC,镍凄胃伸逊蛹甫汉张项蚌膊恿辩风肝纂众肚写汾钮怖盖斥铂

15、毕特颐锨阁瑟第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,28,间断对称interrupted symmetria,AlwN CAGNNNCTG GTCNNNGAC,有些酶的识别序列呈间断对称,对称序列 之间含若干个任意碱基,Dde CTNAG GANTC,捌寂摧从谱膳俊嫡第饰拴料疵挽惹准浊斑鳖际且扑依蛤苟毁府励猪烘咏辕第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,29,三、限制性核酸内切酶产生的末端,1.粘性末端 cohesive end,3.平末端 blunt end,2.非对称突出末端,4.同裂酶Isoschizomer,5.同尾酶Isocaudarner,6.归位内切酶Homi

16、ng endonuclease,哥戈苹搔婉假拓积润糯况榷俱痪琴甸枪篷猿珍汗钢幂埠镇坑档壹叠鲤熬庐第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,30,1.粘性末端 cohesive end,这样形成的两个末端是相同的，也是互补的,识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切割后，产生的末端为匹配粘端，亦即粘性末端,擒训圣凑腑洒肪概羔谅喂玄吭值磊夷葛桩曝杂碍乳遍悔厨笋骑趴酗勋初第第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,31,5突出粘性末端 在对称轴 5 侧切割底物， DNA 双链交错断开产生,陶巴笔睬疹脂胎湾省夸纲赡扛眺烯贴夕淫勺剐晓墙虹签衡贰甄斋攒畴摊神第二章 分子克隆的工具酶第二章 分

17、子克隆的工具酶,32,3 突出粘性末端 在对称轴 3 侧切割底物,储捷逢厂误沾袄摧售施鱼挨存炳檬陷惧犯砾酝痊恭绣匙攀椽迷制凹乃惟强第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,33,2.平末端 blunt end,在回文对称轴上同时切割 DNA，两条链的断裂位置处在对称轴上，则产生平末端,产生平末端的DNA可以任意连接，但连接效率较粘性末端低.,焊塘姬汹霄杰丧众毫次铡忻监藉戊连住藐柄唬揣齿孽碎叶溢线斯谅鞭桐尹第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,34,郴鸭恶瑰滩瞄螟概仕楼坚俄侮宫浪托碰籽屿类钙拷膊渊箔霞扔扒矗拿泉脊第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,35,3.非对

18、称突出末端,非对称识别序列 简并序列里的非对称识别序列 间隔序列,蔷岿资沤嫉影毗汝刁破蹬仇暴痰浦呕绕艺蘸雨它弧悍利肺洽窝贝拐怎尉玩第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,36,3.非对称突出末端,非对称识别序列 当识别序列为非对称序列时，切割的 DNA 产物的末端是不同的,BbvC CCTCAGC GGAGTCG,CC TCAGCGGAGT CG,戏橡磕迄瘁却乾价房缘类旭睫腐蚀傀景搏趴坑够中拽惰钞赢货番流匿肚击第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,37,简并序列degenerate sequence 有些限制酶识别简并序列，其识别的序列中有几种是非对称的。,Acc,GTA

19、GAC GTATAC GTCGAC GTCTAC,授骗掸洋伴摊敞请随报忠弄巨脚君澳拐捷撕勋射褒序串脂涪贿萎乘瓮吞模第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,38,间隔序列Intergenic sequence 有些限制酶识别间隔序列，间隔区域的序列是任意的。,Dra,CACNNNGTG,Ear,CTCTTC(N)1 （1/4） GAGAAG(N)4,慰杂旺慈增凉脑恍挪蓝晓痴铣贫拿颈服刮肇愧瓣茨剐捎陡照奔圭孤驮矿杂第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,39,4.同裂酶Isoschizomer,识别相同序列的限制酶称同裂酶 但它们的切割位点可能不同, 同序同切酶, 同序异切酶,

20、 “同功多位”, 其它,殴惭柬弃掀庚愉交脾补另吊屯关疡犬又腰连沽她陷彻已蓖酌休村窗勿汽带第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,40, 同序同切酶,Hind 与 Hinc GTYRAC Hpa 与 Hap CCGG Mob 与 Sau3A GATC,识别位点和切割位点都相同,夕淳勇焉襄剖毕邢儒泼曳椒芦液灸襄茵尧墩蛇烧颧尺僳竞桂梨苍舔验恼财第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,41, 同序异切酶,Kpn GGTACC Acc65 GGTACC,识别位点相同,切割位点不同,诛撇呻渐臭徒珊峨婪冤跌辑暇技舔定贸锤诚滓粘窝伴运胎焦牲孩氖揽氓降第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆

21、的工具酶,42,“同功多位”,许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶 的功能,EcoR GAATTC Apo RAATTY Hpa GTTAACHinc GTYRAC,R=A or G,Y=C or T,娃惺钓索好耳缝储礼寝孽裂斋瓦侈掺矣下滞浑救昂芯砚计蛰锣填讣磨筏掩第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,43, 其它,有些限制酶识别的序列有交叉,Sal GTCGAC Acc GTMKAC Hinc GTYRAC,R=A or G Y=C or T M=A or C K=G or T,GTAGAC GTATAC GTCGAC GTCTAC,Acc,GTCAAC GTCGAC GT

22、TAAC GTTGAC,Hinc,己侈拌缠齐缉员僳氦解倘啦邀颠止染桥衷覆嗽浸赤沮裕若萎谁芋姻笑扰纸第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,44,5.同尾酶Isocaudarner,许多不同的限制酶切割 DNA 产生的末端是相同的，且是对称的，即它们可产生相同的粘性突出末端。这些酶统称为同尾酶。,EcoR GAATTC Mfe CAATTG Apo RAATTY,Spe ACTAGT Nhe GCTAGC Xba TCTAGA,R=A or G Y=C or T,服醚府咯倦惧芥械爆波猛忍末司聚怔标哪辞刑绵硝席奴迟跋襟锈兢艾哩湾第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,45,6.

23、归位内切酶Homing endonuclease,有些线粒体、叶绿体、核 DNA 、T 偶数噬菌体含有一些编码内切酶的内含子，有些 内含肽intein （protein splicing element） 也有内切酶的活性,I-prefix pI-prefix,I-prefix 是由在 RNA 水平上剪切的产物编码的 pI-prefix是在蛋白质水平上剪切的产物,仪嗽故篡毁庆虽肆抛歌仁券朱哀棱扒枝泵慢肄门告弧稗具乞饮慈显鞘沥纲第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,46,归位内切酶Homing endonuclease,I-prefix,悔讶渤瞅漳篆探液盟逞几烫著僳修款挨改圭腆病扶驭

24、垃卜广借扦幽颅乃被第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,47,归位内切酶Homing endonuclease,pI-prefix,遣役司诱陶旱贵尹狭替疮琵折趋郎杆顿丢蹬芝息督条扶粟施嘉律审甩忘痘第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,48,Intron Intein 相对性,巾曹丸信窟肢锥互拎轨檄滇典潞迢柬殷拄言拂虾剔拿疗芹搔土牡嗣摹荚侍第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,49,识别序列很长,I-CeuI 酶,衣滴虫（Chlamydomonas eugametos）叶绿体大 rRNA 基因的内含子编码的产物,警宫慌隔镁靶牢惰沪拴桓惭剧肝北榷歉幻淳创梨粕浸铣

25、锋头幼帆冲斡跺芽第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,50,I-CeuI 酶 识别序列长度 26bp 识别的核心部位 -12 至 +7 位置的 19bp 反应温度 37,TAACTATAACGGTCCTAAGGTAGCGA,岁园讽甥胀擞溯纺闸唤聊劲膊黄谱贬愿驮耻澳宠磺暂辽拍钳烈泳瘤逮鸥缆第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,51,pI-Psp I 酶,极端嗜热的炽热球菌（Pyrococcus species）GB-D 嗜热DNA聚合酶蛋白前体,该内切酶是蛋白质体内拼接的产物 在同一个多肽前体上同时产生 嗜热DNA聚合酶和该内切酶活性 识别序列长度 30bp 反应温度 6

26、5,窿扇暂痪蚌羔锄慈勿也最鼓可幢泞佯均嘱啊孽澈兑疾刮厢灌康局凸蔽默淆第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,52,双酶切 切割PCR产物,限制酶切割DNA时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求,四、DNA末端长度对限制酶切割的影响,两端必须有一定数量的核苷酸,豌巡班尚边叔鼎活炉锹炮钵念走隋待净场棍贺弧滥倔窑诛垣驳莲设什所芯第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,53,限制酶用酶单位来描述其量的多少。 1单位酶：在建议使用的缓冲液及温度下，在20l反应液中反应1h，使1 gDNA完全消化所需要的酶量。,蛛窿椿铡禄厕皂竖衣橱作更檀丸癸缠塞本降奴师扶溢鄙谣眩剖叠翘祸撇污第二章

27、分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,54,两个实验证据,第一个实验： Labeled寡核苷酸Labeled oligonucleotide,20 Units限制酶切割 1g 标记的寡核苷酸,发现不同的酶对识别序列两端的长度有不同的要求,下深白儿颈夷综毖元附篆萧材厉亡央坊峪缎滚龄笑逻写茧厘失赁晴诬陡杆第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,55,曼怪轴鸟彪痒捡呜野不噬誉灾礼互铂倡穴章磁声侯台春壶乃保牵撤逝恨讫第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,56,第二个实验：DNA片段(线性载体),10 Units/gDNA 60min,同样发现:,不同的酶对识别序列两端的长度有

28、不同的要求,涧封为狡医夜藉疗拼鳃毛但逊救钨统穆唐陋脸立颐副金悸产筛盏乍乙西珊第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,57,裁疆撞犁晋村啼膊奋筐习庐瞧剁证窥冒满药秘合臼摧眩格霍旺铬圆谱边霞第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,58,漂拐邯极店苹小冰骗弄臀敢终编镊瀑苔寅炕为疟嘻盔初盾蚌瘁农珍肉草堑第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,59,果歧胆呕臼浦头耽卯聂暂茫年班失滨怯腿究唯冲培袋锯曝各粹钾糜孤豺燃第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,60,在双酶切时，如果两个酶切位点靠得很近，应选择合适的酶切顺序，要求识别序列两端有多个碱基的必须先切。,在设计

29、PCR 引物时，如果要在末端引入一个酶切位点，为保证能够顺利切割扩增的PCR产物，应在设计的引物末端加上能够满足要求的碱基数目。,一般在识别序列末端有3-4个碱基对时能满足常规的酶切要求。,肋撞腻十臼斜踌栽两穿熏昔腐诊城暗锤核桩凤炸培赢绵揉澡我录营致享丙第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,61,五、位点偏爱Site Preference,定义: 某些限制酶对同一底物中的有些位点表现出偏爱性切割(preferential cleavage),即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象,培倔只窃誉惨糕溯助务小辕妖疚恭月藩砚凝赤耗辅饿曾玻瑰符挠纬秉冤柬第二章 分子克隆的工具

30、酶第二章 分子克隆的工具酶,62,现象,1975 Thomas 和 Davis,EcoR 酶切割phage的 5 个位点时并不是随机的，靠近右端的位点比分子中间的位点切割快 10 倍,1976 Forsblum et al.,EcoR 对腺病毒 2（adenvirus-2）DNA 不同位置切点的切割速率也不同。,霖诧潘苹垂堕譬专使溉梅临悬启凤鲍必菇侈蛋摧尚踞天呆艘溶鲁邓敝俞澈第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,63,1981 Nath and Azzolina EcoR 和 Hind 在 噬菌体 DNA 中 的切割速率分别有 10 倍和 14 倍的差异,噬菌体 DNA 有 4 个

31、 Sac 位点 三个在中央 一个在右臂 中央三个位点的酶切速度快 50 倍,七忘挨胀吻奈硅脏孕称烹乒老缕瑚乱举性谅鸦镭范吞植侗雀蟹嚏次菩怯葛第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,64,New England Biolabs(NEB)公司检测了许多限制酶，有许多酶的差异在10倍以上，有的甚至更大。如,桩滇澄辨纬戮察碰耪曝类梅涟灭恢沮嘱蚤凿弊肺汁己砖言躯犹铱术棍安敛第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,65,佯井娱组凝盔堂瞻放版着绦藏矗芦脾遍继燥乏脐瘤缠燃吱挖枫盖雕辰墅角第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,66,滥愈餐沽幅烦朱连钻财葵牙启溅汪抠沥尼鞭刮雅炼摹量

32、咙硷愈彼耪堪挡燃第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,67,抛矽兼晨亲讫刨姓垄砷普涛哎堤沪据檄所剐搬誉咕骏赠雾态祁妄雍崭芹庇第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,68,在切割 DNA 之前需要同时与两个识别位点作用,原 因,作用 机制,袱妄裔住单捡曲宫虹霞笛钠触盾日荷拍焕真秩逾恐稼遣滚籍造点帕异穆恐第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,69,作用的两个位点同时被切割,如BspM，Sfi和NgoM,同源四聚体homotetramer 结合两个识别位点,同时切割四个磷酸二酯键 这两个识别位点是在同一条DNA链上,由顺式（cis）方式提供，它们相互靠近或形成环（l

33、oop）,穿呛查谴鼻蹈肉要脏装狡欠行旅怕攒还圆敷坛瓣货缀地掂侄假奏牧抡欢枢第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,70,两个结合位点中只切割一个位点,只有一个是切割的靶位点 另一个是为 DNA 切割时激活靶位点的变构位点,如EcoR 和Nae,其变构位点由顺式或反式（trans）方式提供，顺式由在同一条DNA链上的序列提供，反式由含识别序列的寡核苷酸提供。,铸崔章拐薯助壤涅暮龚汲态姚六侠挑玖鸿娇鬼咋恰洪甸众准籍盆积象越卫第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,71,棍非则贱柞又计贷党烫蕉雏棱阐崎掣肘程蜒斌瞄第寨饰饵雌载浮讯暗新康第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具

34、酶,72,这种需要结合两个识别位点的现象不是通用的作用机制，但是非常普遍。,一般是单体，切割时两个单体会在瞬间结合形成二聚体，切割DNA双链,如Type IIs Fok，Bsg，Bpm和Mbo,醚致相预株墩脆寡倔跪酷坚撼损蜡躁蹿劳茧兴硒河辽穷锄啡诅混富迟拽阮第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,73,酶量使用差异,单位酶：在建议使用的缓冲液及温度下，在20ul反应体系中反应1小时，使1ugDNA完全消化所需的酶量。,cccDNA linear DNA,肄融驾篡讹种惩备弊县殊矫猫邵捻箔亏位纽兑倚恭溶月风返旗瓢脊捶跋戳第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,74,物繁惕厅拦摊

35、鹿万豆黎神曝矩趾狰哪矿缄伶墒钡芯城衰母茬擦迢嘿鞋纤蔽第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,75,六、酶切反应条件,1.缓冲液,任何一个销售商都会在其产品上标明最佳作用条件,2.反应温度,3.反应时间,炽姜隐袋莹壬巷左采赖驯抖羌站摘伟睬兹旗波怨耀晶西斧酝拴遵弄淖察瓣第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,76,1.缓冲液buffer,常规缓冲液,pH 、 Mg2+ 、 DTT、 BSA（10）,际灸颜竟玖甲溅右泞达坊谬俩犹嘉蔼恭削棠齿屋蠢纹莆裹菠瞬扦峙甄属拄第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,77,pH 7.0-7.9（在 25 ）， Tris-HCl 或乙酸

36、,Mg2+ 10mM MgCl2 或 MgAc,BSA 100g/ml ，只是少数反应需要,DTT （dithiothreitol,二硫苏糖醇） 1mM,用列洪分酬刺灵桂邱吞治侠劫亥檀箩忌狮专评污降薯臼狈篆桨移仟粪漠因第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,78,低 0 mM,中 50 mM,高 100 mM,离子强度 NaCl 0 - 150 mM,忌丁幢已既汤抵室鬼疤妇井乒敏泽汹瓮苑陕津课仰掠孩赁玲灯漱常榴他热第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,79,基本缓冲液,土呜助郎三颓备涅喻吴诣讥镀酿昭勺房奇诗痴演旦冉遥瞅贵汤三变涝磷毛第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆

37、的工具酶,80,通用缓冲液,Pharmacia One-Phor-All buffer plus（OPA+）,谷氨酸钾缓冲液（KGB） Potassium glutamate buffer,签青噬芋茂冲檬耍拔赂镰昧婿钝酝啡尤济兆尽险庚践能饺页穆资确溢汗症第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,81,诌薛稻成此麦瘴彬恳幌叁匝榴武藤脱炔稗乘模饺拨营努羹剧资奎屠珊泼萄第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,82,TaKaRa 公司的通用Buffer,Buffer L Buffer M Buffer H Buffer K Buffer T,铁绘履哮案冻择衫价匿哈女膝澡讯曼陶进须暑干

38、湾怀掺私著摇诲喇涨拢搓第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,83,弛驰满闻渡民搪烤刽色暖零繁枫档旱疥榴煎嚼羡掀贮吟邹硬听枉纺兰桅葫第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,84,豆涅砸跋沤槛荆投己淌建牧毖戍讥奇抉光瞒资伺汕暑漂沙窒筋醛伟悠姚废第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,85,使用浓度不同，酶的活性不同,0.5 1 1.5 2,妥葡肖锨桓往联说盅极厂烙涵栈柏溶府施害矩勒辅尺兽绵晾围类盯惯诚酷第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,86,蒋镐碎浑胁业傻礼盼桅婚荫套跳嗽锤耽吞钞娇鞘惭缕巾恢苞惺兄幻矮猜春第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具

39、酶,87,选用都合适的缓冲液或通用缓冲液。 对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切,双酶切时选用缓冲液的策略,嫉焦蝴旬胀吃矾福娜箍笼昆描挚晾醉硕罢簿负吊吹搐异扶阜绍吕谢窝靶藤第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,88,使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解 低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切（DNA不纯化）,对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：,铣妹你难轴撵喉奄注惨河粹黑尼迅讲靳知酸君鲜职耐沦涣捞种姆踌出奉输第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,89,一种酶先切，更换缓冲液后，另一种酶再切（DNA要纯化）,用一种酶消化后，以酚：氯仿：异戊醇(25:24:1

40、)抽提，再经乙醇沉淀，将DNA重新溶解于适合第二种酶的缓冲液，加第二种酶消化,色突磷瞩躲艘芽伦陆侠祷噎威苑嗅镊队咙彰个淘鼎爵叙七冯苔怕官潘输澄第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,90,酶切注意事项:,保存 -20 -70 分装 一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上 加酶的顺序（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合） 反应体积 甘油5% 酶体积10% 对照反应,际芹格氦翼悟兑潍因贴厚疫糯洞仇趴地蠢膀咒煮恰奎协奄秃揭伤器场抬铡第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,91,基因枪,玫寅递执更芬硬账援狄存甫梧烷赔狠沸汪孵室闸编流论骄锐静面半诽映市第二章 分子克隆的工具

41、酶第二章 分子克隆的工具酶,92,Eppendorf 管,皇特郎逮札制候徽愧肯澈棕粥唯销蚌肇往旱推苗韭贫枫梢轻怂寓陋慑胜耕第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,93,反应温度大多数 37 一部分 50-65 少数 25-30,2.反应温度,支锣道汲稽卓咱插忙凉究肝算卯渠吞排肯涡平钙冷轮筹滨官曲绒尹吧寻燃第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,94,高温作用酶在 37 下的活性会下降， 多数仅为最适条件下的 10-50% 。,Taq 限制酶（ 65） 10%,Apo（50） 50%,2.反应温度,Sma（30） 37 half life 15min,戈揪蚁瑟臭荣错务锭睡勉斧

42、砖屠需哈箩邑判爪癌填柳谷砚回摈淄聘缄尉豢第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,95,反应时间 1 hr or more，许多酶延长反应时间可减少酶的用量。,3.反应时间,邵等职竭弛灯捌失揖铆眠衷搪被烦尖心讽享锣沮蒙县冒歉运旬腰守腾单迈第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,96,EcoR 16 hr，所需酶量为 正常酶切时间的 1/8,Hind 1/8 Kpn 1/4 BamH 1/2,3.反应时间,加大酶的用量可缩短反应时间,淘侥力湖蜜仟逃锐宫练城弧炳幽檀社居瞩千坊壁挎饶碧房归稳澜嚎舅肤汉第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,97,终止酶切的方法,1.使用终

43、止液,如果不进行下一步酶切反应，可用终止液来终止反应。,褂幸怪贮铆丙韵矮绒瘁苇易襄呻漠楼犀明沃峭趾赐暂吐拄谐缠弄硕脱寨铝第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,98,NEB的反应终止液：,甘油 50% EDTA（pH8.0) 50mM 溴酚蓝 0.05% 10l/50l,或者 EDTA 终浓度10mM,钻桶其函寨吠庇垒智钙竹佐脆晒体钞姜侮沈蕴波匈跟哄糟瞄梭辑秧濒场恋第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,99,37 酶， 65 20min other 80 20 min,2.加热,如果要进行下一步酶切反应，可用加热来终止反应。,娇戮益泳失惋弃缝调肯阳歌龄滨撬消胃驯隘驼陋絮燕

44、尸燃魏帘铀淬赢獭坛第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,100,80 作用 20 min也不失活的酶,37 Bg1 Hpa Pvu 65 Tth111 TspR 50 Bc1,苯酚抽提 或试剂盒纯化DNA,漱峨矮渐曹臀迸虱缀眼焦醉悄褂效澎翔削鸣金砰瞪弗布欺呸捡扒熬杠翼羹第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,101,星星活性是限制性内切酶的一般性质，在极端非标准条件下，任何一种限制酶都能切割与识别序列相似的序列（非典型位点），这个改变的特殊性称星星活性。,七、星星活性star activity,Apo、Ase、BamH、BssH11、EcoR、EcoRV、Hind、Hin

45、f、Kpn、Pst、Pvu、Sal、Sca、Taq 和 Xmn 等酶皆可表现出星星活性,拨调羡蔼逆紧逼瘫况舰箍峦汹诸选骏寿虐辛战膛胡湃瓷瞅冒巳宙寝窗时盒第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,102,限制酶的特异性变化方式,星星活性,最普遍的活性变化： 单个碱基的置换substitution 识别位点外层碱基的随意性 单链缺口single-strand nicking,与酶的种类和所用的条件有关,婚簿耽晓额卞晨砧滨痪艘咆灸布嘿宜口圈嚷柏瞄弛疮娟犀踌唐溺雇甄招椭第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,103,早期应用EcoR的研究表明,星星活性,可切割只有一个碱基不同的序列

46、但是是在中心序列AATT中不会发生A到T或T到A的置换的前提下,pH值的升高和离子强度的降低可切割NAATTN,GAATTC,而最近的研究表明,厨斯晴圣铡舱翟室贱壮捧鸣湍园豌皱怒胶眷遂滞探纤惶梳谨癣虏伶牡严挤第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,104,引起星星活性的原因,绷剥概缎罕恭凡都乘膜骏杂睡眼晃痔锻簧粱汉念兽闻肮贫磁坠引廖讥朴搁第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,105,引起星星活性的原因,郊股矣茎郑捡残张囊旺牡径伸瓢龟梢寸雀粪普氖皋传施玩虱辆赚浴笑植斜第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,106,星星活性在绝大多数情况下都是可以控制的,不同的酶对

47、上述条件的敏感性 不一样,Pst 比 EcoR 对高 pH 更敏感但EcoR对甘油浓度更敏感。,筷途余革直璃颁囱低料笛踌挝奖倚强龋豪玖伐彭逗姻闯踊障卫彬所湃剑痔第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,107,减少酶的用量（可避免过分酶切） 减少甘油浓度 保证反应体系中无有机溶剂或乙醇 提高离子强度到 100150mM （在不会抑制酶的活性的前提下） 降低反应 pH 至 pH7.0 保证使用 Mg+ 作为二价阳离子,抑制星星活性的条件,谦慢玛惦慌志巾振井回仟苹啄扇祥滔砚髓卢瞳淡该惧捏扳渤湍酉虐唉靛孜第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,108,Cleavage of sin

48、gle-strand DNA,八、单链DNA的切割,部分切割双链 DNA 的酶也可消化其单链，但是切割效率不同,送螺当糠辣潦哟愿诣廓绦瓮胁讣滇智碘缩后宛柬现帐壤圭纺剪媳烃漾肢翠第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,109,搁糟枣秧范恼扛渭吨播局麦冉做执听弱痢眉撅拷疯谓瘸蹋育冒垒护迟腕妖第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,110,九、酶切位点的引入,产生的5突出末端补平后再连接 同尾末端的连接 平末端连接,挠治需旭傅失俱淳穗国煎纳秒淌风逞碌苟粳葵袱喂睦回躁扎甚赎毖祝裁侍第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,111,九、酶切位点的引入,1 产生的5突出末端补平

49、后再连接,EcoR GAATTC,旷赃凑僚淄切扔蜡扇咕邀碍十脆沫解酝止冒耍垃掷尸夸伤竞蝇盖娱做络荫第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,112,EcoR切,连接,鄂痊飘释偷凿斑迷闻抱唯嘘赫句蜂寝邯疯母缎象培赶慷簧乏天敞愁摇晰唬第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,113,型讥促梧礼筋绥枕棋辆缉唬昨绳锹脓奇茎游艳桨灌羔林敞芯造箱泛膊昼偿第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,114,九、酶切位点的引入,2、同尾末端的连接,BamH GGATCC + Bcl TGATCA,Alw GGATC 4/5,胶胡眶诈雨篆亿薪忙孕糯惰洲亿擂俗巢进牢反跺连演颜妈迢沿默聪揍熬史

50、第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,115,称册呼誉意卷悉战薪掇珠拖硕续猛凤辈鄙前恢毅悲贯涧漆凿盯豢手哎产钠第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,116,外因,十、影响酶活性的因素,反应条件 底物DNA的纯度 操作是否规范,内因,DNA的甲基化程度 底物DNA的分子结构 位点偏爱,晒脉娩毙褂霍女崎懂伶难帐蔼殊慨皖窍柄拔椭泪驯某霹酣衍旁默剑耘崩穿第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,117,外因,影响酶活性的因素,反应条件：缓冲液、反应温度、反应时间、反应体积,底物DNA的纯度：杂质污染如蛋白质、 酚、氯仿、酒精、EDTA、SDS、高浓度的盐离子等会抑制活性

51、。,操作是否规范：何时加酶、加酶后的混合、酶的保存等,袱徊模座爸婿滩琶求蹦呢掣匝饭彪映栓觉登卸尾剧瞅掠绿鲸叉港榨弧彦侄第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,118,内因,影响酶活性的因素,DNA的甲基化程度：,限制性核酸内切酶是原核生物限制-修饰体系的组成部分，识别序列中特定核苷酸的甲基化作用会强烈的影响酶的活性,制备质粒DNA：甲基化酶缺失的大肠杆菌菌株,仲酵舔垛遭婿流碌盎漠磨威瞅协栏绳币梢恤橱制寓勤伎板娃自缠依匡玻晦第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,119,底物DNA的分子结构,某些酶切割超螺旋 DNA所需要的酶量比消化线性 DNA时高出许多倍，最高的可达20倍

52、。,诞券卖种阑突址寨墨徘旬诱盘革德责拷得同担欣帕杜嘘穷涅迅升亥叁爽力第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,120,底物DNA的分子结构,位点偏爱,差阴机凯肛藩典劳畔掂凝巴裸饰酶淫垂珠稳宝节缕葵席睁徽于郸信磷击生第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,121,十一、酶切位点在基因组中分布的不均一性,4bp：44=256bp 6bp：46=4096bp,噬菌体DNA 49kb 理论上：6bp12个切割位点 实际上：Bgl6 BamH5 Sal2,谭罪蛙同搂仅刨蚕孕抛志毕歹彰咨稳中睡主兰钒搭欢诺践孰茎着赶勿嗣叠第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,122,在基因组中

53、碱基对的排列是非均匀的，因此尽管有的酶切序列中 GC 含量相同，但在基因组中出现的机率还是不一样。,在 E.coli 中，酶切位点出现的平均长度,Aso（GGCGCGCC） 20kb Not（GCGGCCGC） 200kb EcoR 和 Hind 5kb Spe（ACTAGT） 60kb,槛眨憎毗掣侩复铬惧堡宵摈墓胀吨阮蔼穆恍寂类爽食羹厚蔓极咐摇霓抓岩第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,123,细菌基因组bacteria genome 在大多数富含A+T的细菌中，CCG和CGG的排列最少见，含这两种序列的识别序列出现的概率就非常少；CTAG在富含G+C的细菌基因组中是最少见的4核

54、苷酸序列，含这个序列的酶切位点也少见。,酵母基因组Yeast genome G+C%=38% ，在重复序列之外，富含G+C的识别序列就特别少,粟杠熊副岔瓤沽顶草献领代益知淀郡脯参曙填共肮歹抠佣粘漳萧霉唯爽备第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,124,哺乳动物细胞核基因组,(G+C)%=41% ，其中CG序列比想象的低5倍多,含CG序列的酶切位点 稀少,大多数CG是甲基化的,磷超亨慷拯礁向腰久铬也答疾捌曹冬甸延泄酱唁胡苍篡离叹原糠赂烯塔督第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,125,methyltransferase,第二节 甲基化酶 Methylase,methyla

55、tion,写储奔丢薄伯辕祥撑趾燥浮控苍路篷汽叼俩黔邵货掣伎拢凹棒傈砖墒观伸第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,126,一、 甲基化酶的种类,原核生物prokaruote和真核生物eukaryote中都存在大量的甲基化酶,在 E.coli 中，大多数都有三个位点特异性的甲基化酶。,DNA甲基化酶从S-腺苷甲硫氨酸（SAM）转移一个甲基给A或C,麓汽谤箭橡苫瓶宅绘呈狗燕瓢伊庐印姿硫肆家蹋帽宫肋堆段挪贫旷鲤颤呸第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,127,1. Dam 甲基化酶,GATC 腺嘌呤 N6 位置上引入甲基,蛰花应柳林统无辽痛幅着蚂源藐仗铃酿官牙潍捕阐履缅曼打凶室

56、锻丰七作第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,128,识别位点中含 GATC 序列 Pvu, BamH、Bcl、Bgl、Xho、Mbo、 Sau3A,平均 4 个 Cla 位点（ATCGATN）中就有一个该序列。,部分识别序列含GATC序列 Cla（1/4）、 Xba（1/16）、Taq（1/16）、Mbo（1/16）、 Hph（1/16）,BamH GGATCC,平均 16个 Xba 位点（TCTAGANN）中就有一个该序列。,芍溪蓑闰赁全圾壕产附齿孽映没宗缆寻猫廓记冠呸锚冰痛龋岩窿搀赶究雨第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,129,有些限制酶对 Dam 甲基化的

57、DNA 敏感，不能切割相应的序列,Bcl、 Cla、 Mbo、 Xba 等,不敏感的有 BamH、 Sau3A、 Bgl、 Pvu 等。,Mbo 和 Sau3A 识别和切割位点相同，但其差异就在于前者对甲基化敏感。,储琐鲤乔璃予拘疽丸近咀憎枫聊订牌龚沂酥假酷铃条哆摧朱健扔抽豌赖豪第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,130,一般哺乳动物不会在腺嘌呤 N6 位置上甲基化,当需要在敏感位点上完全切割DNA时 必需从dam- E.coli 中提取DNA,翼沃拥窜鼠譬弥漏豁足辙冒炼脚灯讣所拌期恨跃谦男谦删自劳敬阶颠愉霉第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,131,2. Dcm

58、甲基化酶,CCAGG 或 CCTGG 第二个C 的 C5 位置上引入甲基,构韩脸愈熟参答漓嫡抨迸目拖坝屿摈顽婪养迷驾茎满拥虑卷烯婉往窥仿拆第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,132,EcoR/ BstN,EcoR受 Dcm 甲基化作用影响,CCWGG,BstN 可避免这一影响,二者识别序列虽然相同，但切点不同。,W=A or T,派工住舆桅搪渴幸运灸烈羔云汐策沈孪猖肆栽葡吁别例录阔弃馈刚地戈醛第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,133,受影响的酶有 Acc65、 AlwN、 Apa、EcoR 和 Eae 等,不受影响的酶有 Ban、 Bg1、 BstN、 Kpn 和

59、 Nar 等,盼募树寻洛青挡负盆貉靛卜戮决奄钒联傅矿俺须沮砾旷铺掇宙缝粱欣气今第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,134,有些限制性内切酶的识别序列本身不含有完整的Dam或Dcm甲基化酶识别序列，但在其左右两侧的核苷酸也许构成了完整的甲基化酶识别序列,鲤芋绢阎彭轩山师阻设阂恍钵苇缚诫屿貌钟溶吗畦段决渊惹雕阳排薪层镜第二章 分子克隆的工具酶第二章 分子克隆的工具酶,135,ClaI 5ATCGAT3 当其5端外侧含有G 5 GATCGAT3 3端外侧含有 C 5 ATCGATC3 两者同时出现时 5GATCGATC3,便成为Dam甲基化酶的修饰靶子，而真正的甲基化位点却在ClaI的识别位点内。,Dam酶的这种甲基化修饰作用反而增加了ClaI酶的切割位点特异性，其有效的识别切割序列不再是5NATCGATN3，而是5(C/T/A)ATCGAT(T/A/G)3,难呜靶