第9章原生质体培养和体细胞杂交.ppt

1、第九章原生质体培养和体细胞杂交，原生质体：除细胞壁外的植物细胞成分原生质体研究的意义：1。研究植物细胞壁的形成；2.实现细胞融合和细胞杂交；3.通过细胞从外源基因、DNA片段、细胞器和染色体中捕获原生质。它为植物基因工程研究提供了一个方便的基因操作实验系统，以及分离原生质体的方法；1.用机械方法将叶肉或其他细胞置于高渗蔗糖溶液中。切割组织可以释放原生质。缺点：产量低，不能从分生组织中分离原生质体。2.酶法(详见第一节)1960年，首次采用了考克宁法，并实现了原生质体培养。1971年，Nagata和Takebe从烟草叶肉细胞原生质体中获得了完整的再生植株。中国学者首次从50多种植物中获得原生质体

2、再生植株，并获得各种植物的细胞杂种。中国科学院植物研究所、遗传研究所和上海植物生理研究所做出了重要贡献。第一部分是原生质体分离。1.材料来源和预处理双子叶植物的幼叶、子叶、根和下胚轴的片段通常用于制备谷类植物的原生质体。松散易碎的愈伤组织或悬浮培养细胞是制备原生质体的理想材料。预处理旨在改变细胞和细胞壁的生理状态，增加细胞膜的强度，提高酶解效率，减少原生质体损伤。1.通过暗处理枝条获得的原生质体是活跃的，可以继续分裂。2.叶片萎蔫处理有利于剥离下表皮和分离原生质体。3.预培养叶片，撕下下表皮，在培养基上预培养一段时间以诱导愈伤组织，然后酶促分离细胞壁，从而增加原生质体分裂的频率。4.前质壁分离

3、处理：首先在糖溶液中进行质壁分离，然后酶解除去壁，这样可以加速原生质体的释放，提高其活力。5.胚性愈伤组织和悬浮细胞系的预培养原生质体在新鲜培养基中预培养一段时间后分离，质量好，分裂频率高。制备原生质体的酶：纤维素酶：从绿色木霉中提取果胶酶；从根霉中提取；将植物组织分解成单细胞裂解酶；具有纤维素酶和果胶酶活性，用于从根尖细胞和培养细胞中分离原生质体；蜗牛酶：对孢粉和木质素有一定的分解能力，能从花粉母细胞、四分体、小孢子或老植物组织中分离原生质体；酶溶液的制备；为了维持释放的原生质体的活力和膜稳定性，酶溶液应满足以下条件：1 .酶溶液的渗透压必须与处理过的细胞的渗透压相似。在同一株植物中，从子叶

4、和下胚轴分离原生质体所需的渗透压最高，其次是愈伤组织，胚性悬浮细胞所需的渗透压最低。原生质体培养基可作为溶剂，其渗透压适宜。2.为了提高原生质体膜的稳定性，在酶液中加入氯化钙、磷酸氢钾和葡聚糖硫酸钾。还可以加入硝酸银减少酶水解产生的乙烯，加入超氧化物歧化酶减少O2自由基对细胞膜的损伤，从而提高原生质体平板种植率。3.吗啉乙基磺酸作为酸碱度缓冲调节剂，在维持水解产物的酸碱环境中起到缓冲作用，增加原生质体的释放量和稳定性。4.酶溶液的最适酸碱度范围为5.45.8。酶溶液制备后，过滤并灭菌以备后用。原生质体制备，原料与酶溶液的体积比为1: 10，酶解时间因原料而异，酶解温度2530，在黑暗或弱光下静

5、置或摇床酶解，原生质体活力检测方法，1。形态：叶肉细胞的活原生质应该是绿色的，叶绿体和细胞中的小颗粒在不断运动；来自愈伤组织或悬浮细胞的原生质体可以根据原生质体在细胞质中的循环速度或颗粒内含物的布朗运动来判断。2.染色：1 .酚藏红花或伊文思蓝染色显示活原生质体未染色，死原生质体稳定在荧光显微镜下观察，所有的绿色荧光物质都是活的原生质体。第二节原生质体培养方法1。供体材料：单子叶植物不同。培养基中的无机盐：铵离子的浓度可以大大降低。硝酸盐氮只能使用，有机氮源可以同时添加。钙离子浓度可适当增加，以提高原生质体膜的稳定性。碳源和渗透压：葡萄糖是最合适的，应该过滤和消毒。原生质体培养必须提供一个等渗

6、或略低于细胞内渗透压的外部环境。有机添加剂和激素：VB1，VB6和烟酸是必需的。在许多情况下，只需要生长素，尤其是2，4-D条件培养基：经过一段时间后，用于去除细胞的培养基的酸碱度为5.65.8，常用的基础培养基：KM8p和NT KM8p:高通过MES、硫酸葡聚糖钾等进行调节。用于豆类和谷类的原生质体培养。双子叶植物原生质体培养基通常过滤和消毒原生质体密度以培养单个原生质体。原生质体培养方法2，2，培养方法：固体培养：琼脂或平板培养。原生质体的再生、生长和分裂可以在一个固定的点上观察到，但分裂缓慢且操作繁琐。液体浅层培养：简单，对原生质体损伤小，易于添加新鲜培养基和转移培养，但原生质体分布不均

7、匀，易粘附，难以定点跟踪。液滴培养):可用于多组合实验，也可用于融合和单原生质体的培养和观察。但是它是挥发性的，可以被矿物油覆盖。护士培养):使用分泌生物活性物质的细胞或组织培养物作为营养来促进原生质体的分裂和生长。第四节原生质体融合和体细胞杂交，体细胞杂交：仅通过体细胞融合而不进行任何有性过程的方法。原生质体融合：1 .自发融合2。诱导融合：异源原生质体：由不同来源的原生质体融合而成的杂种原生质体。纳米3处理：异核体形成的频率不高。高酸碱度-高浓度钙离子处理：高酸碱度可能对原生质有毒。聚乙二醇处理：双核异核体形成的比率非常高。选择杂交细胞的方法如下：1 .使用不同需求的外源激素；2.使用不同的生长习性和愈伤组织颜色；3.使用互补突变细胞系；4.根据原生质体形态机械分离杂交原生质体；鉴定体细胞杂种；1.观察形态学；2.检查生育能力；4.检查染色体数目和核型；4.生化和分子生物学试验；细胞质杂种。胞质杂种：利用不对称细胞融合技术，可以将一个亲本的原生质体与另一个亲本的细胞质结合。这种有一个亲本细胞核和两个亲本细胞质的体细胞杂种称为细胞质杂种。细胞质杂种有三种产