荧光原位杂交.ppt

1、添加签名或公司信息，荧光原位杂交，fish原理，荧光素直接标记的已知核酸分子探针，探针和靶序列双链DNA变性后交配，互补的二元单链DNA，FISH开发，1969年，同位素标记dnna1974年，染色体现代技术与原位杂交相结合。1981年，荧光标记的cDNA探针；90年代以后出现了多色探针。探针开发、放射性段宜恩：灵敏度和分辨率这两个原地杂交成功条件很难满足。灵敏度必须在放射性标记上有高级中学辐射能(P32)，如果档案标记能量太高，则信号散射可能会降低分辨率。使用低辐射能的放射性标记(3H)，分辨率高，但灵敏度低，曝光时间长，北京太高，很难辨别实际信号。郑智薰放射性封面：常用的生物素和荧光素。生

2、物素通常与dUTP等核苷酸三磷酸连接。牙齿修饰的核苷酸三磷酸通过酶混合在探针中。荧光素核苷酸三磷酸在DNA聚合酶的作用下可以混入探针。常用的荧光素有：二硫氧荧光素(FITC)、羧基荧光素(FAM)、四氯-6-羧基荧光素(TET)、吲哚二羧基氰化物(Cy3，Cy5)等牙齿。根据来源，可分为“cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针和RNA探针”。1.“CDNA探针”以MRNA为模板，合成与逆转录酶催化的mRNA互补的DNA链(cDNA)，用碱去除mRNA。2.“基因组探针”是通过超声波切断染色体DNA，或没有用限制性内切酶完全分解，得到很多染色体DNA随机片段选择长度约为15-20kb。3。“果核

3、苷酸探针”是人工合成的DNA片段，通常生长约20-50个BP(碱基)。根据已知的DNA或RNA序列，可以合成准确、互补的DNA探针。如果不知道核酸序列，就可以根据其蛋白质产物的氨基酸顺序提取核酸序列，合成DNA探针。DNA自动合成器的出现使得探针的合成非常方便。4.“RNA探针”准备的技术是将包含全部或部分基因的DNA片段放在片段中适当的部位插入酶，或在片段下游的某个部位消化，成为线性DNA。在相应的DNA依赖性RNA聚合酶催化下，以包含目的基因的DNA片段为模板合成RNA探针。RNA探针是单链的，因此杂交时没有第二链的竞争，比经过槽口转换标记的DNA探针灵敏度高。探针的郑智薰放射性标记，间接

4、标记：生物素标记DNA探针，杂交后用荧光素的抗生物素抗体检测。(可以放大检测信号以检测小于00 b的靶序列)直接标记：通过荧光素直接与探针核苷酸或磷酸盐骨结合，或在用槽口转换法显示探针时混合荧光素核苷酸三磷酸标记探针。(检查步骤很简单，但不能放大信号。比间接标记的探针不敏感)，切口转换法：切口转换标记法首先胰腺DNA酶I在DNA双链中随机切割，大肠杆菌DNA聚合酶I作用始于切口，以其他DNA链为模板，以4茄子三磷酸二氧核苷酸为原料，沿切口解密5段核苷酸和3。(引物扩张法)牙齿方法和切割转换法一样，利用DNA聚合酶合成与模板互补的新DNA链。DNA聚合必须在3-OH的末端合成，因此与切削转换不同

5、，引物扩展法需要与模块化序列互补的寡核苷酸。将其与模板交配，提供3-OH端。探针类型、1、染色体单序列探针、酵母人工染色体、细菌人工染色体等各种人工染色体探针，主要用于识别染色体的前卫、缺失、扩增。2.染色体油漆探针(包括通过流式分离或显微切割获得的整个染色体或染色体癌和特异性区域的油漆探针)用于检测染色体数目或结构异常。3、染色体重复序列探针，主要用于centromere-卫星DNA重复序列探针和端粒重复序列探针，检测染色体数目异常。染色体染色探针：易位染色体，8号染色体探针，-卫星DNA是所有人类染色体丝粒子区域中唯一存在的丝DNA(centromere DNA，CEN-DNA)家族，171bp的团体，因此经常被选为丝探针的来源。FISH技术的优点，FISH技术是非破坏性检查系统，具有1、荧光试剂和探针经济、安全等优点。2、探针稳定，标记后2年内可用。3、实验周期短，能迅速得到结果，特异性好，定位准确。4，FISH能找到长度为1kb的DNA序列，其灵敏度类似于放射性探针。5、多色FISH在同一核心上显示不同的颜色，从而同时检测多个序列。6.幻灯片上可以显示中期染色体数目或结构的变化，也可以在显液中显示肝气染色体DNA的结构。应用of FISH，基因组结构研究；染色体超微结构变异分析；病毒感染分析人类产前诊断肿瘤遗传学，基因组结构研究，染