DNA酶切及凝胶电泳.ppt

1、,DAN酶切及凝胶电泳,DNA限制性内切酶的酶切分析,限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子特定的核甘酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类DNA水解酶，是体外剪切基因片段的重要工具，常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。,限制性核算内切酶的相关知识： 寄主控制的限制与修饰现象 核酸限制性内切酶的类型及基本特性 同裂酶和同尾酶 影响核酸限制性内切酶活性的因素,1. 寄主控制的限制与修饰现象,限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段。 限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是提高自身的防御能力。限制酶限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种

2、酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能起作用。这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。,2.核酸限制性内切酶的类型及基本特性,按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类：型、型、型。,型：限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类酶如：EcoB 、EcoK等。,型：限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。 这类限制酶识别的专一核苷酸顺序常见的是4至6个核苷酸，其识别顺序是一个

3、回文对称顺序，即有一个中心对称轴。,型酶的切割有两种方式，分别生成平头末端、粘性末端。,平头末端：在同一位置上切割双链，产生平头末端，这种末端可以通过DNA连接酶连接起来。例如EcoRV的识别位置是： 5GATATC3 3CTA TAG5,粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，其断裂的磷酸二酯键和氢键可通过DNA连接酶连接起来。例如：EcoRI的识别顺序 5GAA TT_C3 3C_TT AAG5,型：限制性内切酶有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链，切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末

4、端。 结论：型限制性内切酶的特性使它在分子克隆中得到了广泛应用，是重组DNA的基础。,3.同裂酶和同尾酶 同裂酶：有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，其差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。这些有相同切点的酶称为同裂酶。 同尾酶：有时两种酶切割顺序不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶，可以通过DNA连接酶将这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破坏，有时可能会产生一个新的酶切位点。,4.影响核酸限制性内切酶活性的因素,a. DNA的纯化 b. DNA的甲基化程度 c. 酶切消化反应的温度 d. DNA的分子结构

5、e. 溶液中离子浓度及种类 f. 缓冲液的PH值,用途 用于DNA基因组物理图谱的组建；基因的定位和基因分离；DNA分子碱基序列分析；比较相关的DNA分子和遗传工程。,电泳概述,带电质点在电场中向与其相反的电极进行泳动的现象，称为电泳或离子泳。 基本原理：交替溶液中的蛋白质、肽都具有可解离的基团，在溶液中形成带正电荷或带负电荷或咪唑基的质点。在酸性溶液中，由于 H+浓度较大，它能抑制蛋白质分子中的羟基解离出 H+，使更多的-NH2接受 H+形成-NH2+，因此，在酸性溶液中，蛋白质带有较多的正电荷，在外加电场中，向负极移动；反之，在碱性溶液中，氢氧根离子中和羟基中的氢离子，蛋白质带有较多的负电

6、荷，在外电场作用下，向正极移动。,分类：按照分离原理的不同，可分为：区带电泳、移界电泳、等速电泳、等电聚焦电泳 应用：生物学上的可移动大分子，如氨基酸、多肽、蛋白质及核酸等，具有可以电离的基团，在具有一定pH值的溶液中，能够形成带电荷的阳离子和阴离子，通过电泳方法可以将处于同一体系的不同组分分开。,凝胶电泳技术,凝胶电泳是以各种具有网状多孔结构的凝胶为支持物的电泳技术。同时，凝胶电泳具有电泳和分子筛的双重作用，有很高的分辨能力。凝胶电泳的支持介质一般有以下几种：,（1）淀粉凝胶 （2）琼脂糖凝胶，适用于分离大分子核； （3）聚丙烯酰胺凝胶，普遍用于分离蛋白质及较小分子的核酸。,凝胶电泳优点 (

7、1) 样品不易扩散 (2) 制备简单，时间短； (3) 将分子筛效应和电荷效应结合在同一方法中，提高分辨能力； (4) 需要合成用的原料纯净，制成的多聚物的再现性高，因此样品分离的重复性也比较高； (5) 可以随意控制凝胶浓度，按需要可制作不同孔径的凝胶； (6) 一定浓度范围内透明性好，机械轻度好，有弹性； (7) 链上具有不活泼的酰胺基，没有带电的其他离子基，所以电泳时不会产生电渗； (8) 用途广泛，可以对核酸、蛋白质等生物高分子进行分离、定量、定性、分子量的测定； (9) 需要样品量少，1-100g 已经足够。,琼脂糖凝胶电泳,琼脂电泳是用琼脂糖或优质琼脂粉作支持物的一种电泳方法。该法

8、主要用于研究核酸等大分子物质，是分子生物学中不可缺少的研究手段之一。 用琼脂糖胶分离双链 DNA时，其迁移率大小，主要与样品的相对分子质量有关，而与核酸的一级结构一级碱基的组成无关。利用琼脂糖电泳分离和分析蛋白质和核酸的基本原理是电荷效应及分子筛效应。,以琼脂糖凝胶电泳实验为例，待测 DNA 片段与已知浓度的DNA片段同时进行电泳，根据结合的溴化乙锭荧光强度，分析其含量：,1. 原理 溴化乙锭(EB)在紫外线照射下能够发射荧光。当 DNA 样品在含有适量 EB 的琼脂糖凝胶中进行电泳时，其中插入到 DNA 分子中的 EB 与之形成荧光混合物，使 DNA 发射的荧光增强几十倍。荧光强度与 DNA

9、 含量成正比关系。为了能够比较出待测样品的浓度，只需把已知浓度的标准样品作为琼脂糖凝胶电泳的对照。用肉眼可以检测到0.010.1mg DNA，薄层分析扫描仪可以检测到 510ng DNA。,2.仪器 紫外投射反射分析仪，电泳槽，电泳仪。,图1 电泳槽,图2 电泳仪电源,3.试剂 (1) 6*上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%（W/V）蔗糖水溶液； (2) 50*TAE电泳缓冲液：Trish 碱 242g，冰乙酸 57.1ml，0.5mol/L EDTA100ml，加水溶解后定量 1000ml； (3) 5mg/ml EB（溴化乙锭）：0.5g EB，100ml 双蒸水。,4.操作步骤 (1) 称取 1g 琼脂糖凝胶干粉，加 100ml 1*TAE 电泳缓冲液，加热使琼脂糖熔化均匀，取出后室温冷却至 5060；（制作凝胶液） (2) 将胶倒入制胶槽中，并插入样品梳，待充分凝固后拔出样品梳；（插梳子） (3) 将凝胶板放入电泳槽中，加入 1*TAE 电泳缓冲液，使液面略高于凝胶 1*TAE电泳缓冲液；（加电泳缓冲液） (4) 5l DNA 样品加 1l 6*凝胶加样缓冲液，搅拌均匀后全部加入凝胶板的样品孔中；在另一加样孔中加 5l 已知片段大小的 DNA 标准溶液；（上样） (5) 打开电源开关，电压 100V，电泳约