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文档简介
1、1. 1.基于晶体结构,简图显示基于晶体结构,简图显示 RNARNA 聚合酶核心酶的大致结构,指出亚基、催化活聚合酶核心酶的大致结构,指出亚基、催化活 性中心和利福平结合位点的位置。根据结构,提出利福平抑制转录的可能机制。性中心和利福平结合位点的位置。根据结构,提出利福平抑制转录的可能机制。 答:X 射线晶体图像显示 RNA 聚合酶核心酶性状类似一个蟹螯,转录的过程中 DNA 被夹在中间的孔道中。核心酶组成为两个亚基,一个亚基,一个亚 基。亚基具有 DNA 结合和合成 RNA 磷酸二酯键的作用,为催化 RNA 合成的 活性中心的一部分,同时也是利福平结合的位置。利福平与 RNA 聚合酶的亚 基
2、牢固结合,抑制细菌 RNA 的合成,从而阻断 RNA 转录过程。(图略) 2. 2.全酶的晶体结构中没有包括全酶的晶体结构中没有包括 sigma1.1sigma1.1 区。推断区。推断 sigma1.1sigma1.1 区在全酶的位置,并区在全酶的位置,并 说明支持的理由。说明支持的理由。 答:sigma1.1 区可能位于全酶“蟹螯”的孔道的位置,sigma1.1 区使孔道撑开, 保持了孔道的开放,使得 DNA 链有机会进入。在 DNA 进入孔道后 sigma1.1 便 被全酶所遗弃,孔道因此闭合。所以在全酶晶体结构中没有观察到 sigma1.1 区。 Sigma 亚基缺失前 91 个氨基酸(
3、region1.1)后,全酶结构中有一个狭窄的裂隙, 以至于不能接纳 DNA 模板,表明缺失结构域有可能帮助撬开酶的裂隙,以与 DNA 结合。从而推断出 sigma1.1 区的存在。 3. 3.如何理解如何理解 sigmasigma 因子转换控制转录过程?因子转换控制转录过程? 答: sigma 因子包含于 RNA 聚合酶全酶中, 其与 RNA 聚合酶核心酶统称为 RNA 聚合酶全酶, 它的存在决定着 RNA 聚合酶所转录的基因的特异性, 不同的 sigma 因子识别特定的基因的启动子,从而使得不同的基因得到表达。例如在噬菌体 SPO1 侵染枯草芽孢杆菌的过程中,再侵染的前5 分钟内,SPO1
4、 的 RNA 聚合酶 与宿主的 sigma 因子结合, 表达早起基因, 其中包括 gp28,一种中期表达的 sigma 因子。在 5-10 分钟的时候,RNA 聚合酶与 gp28 结合,进行中期表达,表达出 gp33,gp34,这两种蛋白则是 SPO1 晚期表达所需的 sigma 因子的两个亚基。在 10 分钟以后的阶段,RNA 聚合酶结合以上的 sigma 因子,从而进行晚期表达。 这种 sigma 因子的转换控制转录的过程也在细菌孢子形成, 细菌应对热激和饥饿 时,表达不同基因以应对环境压力方面起到很重要的作用。 4.4.解释解释 NN 和和 NusANusA 在转录终止和抗终止中的作用。
5、在转录终止和抗终止中的作用。 答:在延伸复合物 EC 通过 TL和 TR1区合成 U 串时,第 7 个 U 后暂停,持续 2s. 如发夹形成则终止。当没有 N 和 NusA 存在时,准发夹上游部分与核心聚合酶 上游结合位点 UBS 结合,蛋白质-RNA 键断裂,发夹迅速形成,转录终止。当只 有 NusA 存在时,NusA 帮助打开 UBS 和准发夹上游部分的结合,加速发夹在 暂停结束前形成,促使终止发生,当只有 N 存在时,N 蛋白与准发夹上游部分 结合,减缓发夹形成,使终止不易发生。当N 和 NusA 同时存在时,N 蛋白不仅 与准发夹的上游结合,也使 NusA 容易与邻近位置结合,使发夹形
6、成更慢,终止 更不易发生。 5. 5.利用模型解释利用模型解释 lambdalambda 噬菌体感染的大肠杆菌中噬菌体感染的大肠杆菌中 cIcI 和和 crocro 的竞争是如何导致的竞争是如何导致 溶源态或裂解态的建立?溶源态或裂解态的建立? 答:cI 的大量表达可以阻止早期基因的表达,从而使 lambda 噬菌体保持溶源态, 而 cro 和 N 的大量表达则使之进入裂解态。Cro 和 N 的基因的操纵子 OR和 OL 可细化分为 3 个部分,cI 可以二聚体的形式,以 OR1、OR2、OR3的顺序依次结合 于 OR和 OL,导致 Cro 和 N 基因转录的抑制。并激活 PRm,进一步增加
7、cI 的表达, 抑制早期基因的表达,使得 lambda 噬菌体维持溶源态。而 Cro 则可以二聚体的 形式,以OR3、OR2、OR1的顺序依次结合于 OR,抑制 cI 以及其自身的表达。这样 Cro 便使阻止溶原化的“维持”循环不能实现。从而使 lambda 噬菌体进入溶菌 周期。 6.100%6.100%引起裂解态的引起裂解态的 lambdalambda 噬菌体中,什么可能发生了突变?噬菌体中,什么可能发生了突变?100%100%引起溶源引起溶源 态的态的 lambdalambda 噬菌体?如果噬菌体?如果 N N 基因突变失活,期望得到什么样的细菌?基因突变失活,期望得到什么样的细菌? 答
8、:100%引起裂解态的 lambda 噬菌体中,cI,cII,cIII 基因其中之一或全部可能发 生了突变或缺失,因为 cI 是使 lambda 噬菌体保持溶源态的主要基因,而 cI 的表 达需要 cII 的诱导, 而 cII 在没有 cIII 结合的情况下很快就会被 HflA 蛋白所降解。 因此, 这三种基因对于 lambda 噬菌体维持溶源态都至关重要。 而 100%引起溶源 态的 lambda 噬菌体可能是 Cro 基因发生了突变或缺失,因为Cro 蛋白与 cI 蛋白 竞争结合于 OR是引发 lambda 噬菌体进入溶菌态的主要原因。 N 基因的作用是转 录抗终止,如果 N 基因突变失活
9、,使得 RNA 聚合酶无法越过 TL和 TR1而继续表 达延迟早期基因, 导致 lambda 噬菌体负责整合自身 DNA 于宿主基因组上的整 合酶以及裂解宿主菌的裂解酶等都无法表达, 致使宿主菌既不进入溶源周期也不 进入溶菌周期。然而其仍然可以利用宿主菌的RNA 聚合酶和营养持续表达蛋 白和 Cro 蛋白,而这两种蛋白对宿主菌是无用的。因此,其对宿主菌的影响除 了施加一定的生长压力外无太大影响。 7. 7.在蛋白质在蛋白质-DNA-DNA 相互作用中,氢键网络有何作用?相互作用中,氢键网络有何作用? 答:氢键网络的作用主要还是加强蛋白质与 DNA 的结合能力, 使蛋白以正确的空 间位置嵌入 D
10、NA 双链的大沟或小沟中,从而充当转录调控原件,调控 DNA 的 转录。 8. 8.谷氨酰胺和精氨酸侧链与谷氨酰胺和精氨酸侧链与 DNADNA 之间倾向于何种作用?之间倾向于何种作用? 答:这二者之间倾向于氢键作用。 9. 9.氨基酸的亚甲基和甲基基团与氨基酸的亚甲基和甲基基团与 DNADNA 之间倾向于产生何种作用?之间倾向于产生何种作用? 答:氨基酸的亚甲基和甲基基团与 DNA 之间倾向于疏水相互作用,如甲硫氨酸 的侧链甲基如 DNA 的疏水部位之间的相互作用。 10.10.色氨酸加入色氨酸加入 trptrp 阻遏蛋白后引起蛋白质构象的怎样变化?阻遏蛋白后引起蛋白质构象的怎样变化? 答:色
11、氨酸加入后,识别螺旋 E 的位置发生移动,由下向上,进入操纵基因大 沟,与该位置上的 DNA 完美结合,Sigler 称之为阅读头(reading head),类似录 音机加载或退盘的情况。色氨酸与阻遏物离开, 留下的空隙允许阅读头离开大沟 匹配位置。Trp 阻遏物中色氨酸的邻近分子,上方Arg84,下方 Arg54.形成三明治 结构。Arg54 位于阻遏蛋白二聚体中心,Arg84 位于阅读头的结合面上,因此插 入色氨酸使阅读头推向大沟。无色氨酸时,两个精氨酸连在一起,填补空位。 11.E.coli sigma5411.E.coli sigma54 如何发挥增强子作用?如何发挥增强子作用? 答
12、:大肠杆菌sigma54(sigmaN),氮源缺乏时,可以从另一个启动子转录glnA 基因。Sigma54 可引起全酶稳定结合到 glnA 启动子,但本身不能形成开放复合 物。而是由另一个蛋白 NtrC 结合到增强子上帮助形成开放复合体。 即使增强子与启动子不在同一个 DNA 环上,如能形成连体环,也能发挥作用。 12.12.描述表位附加法(描述表位附加法(Epitope TaggingEpitope Tagging)从酵母中纯化)从酵母中纯化 RNARNA 聚合酶聚合酶 II II 的原理和的原理和 过程。过程。 答:原理:通过基因工程方法,将一外源功能域重组到酵母 RNA 聚合酶 II 的
13、 Rpb3 亚基上,其它正常亚基仍能够与改变了的 Rpb3 亚基组装成有活性的聚合 酶。从而通过免疫共沉淀反应可以将与 Rpb3 结合的 RNA 聚合酶 II 其他组分一 同分离出来。 过程:在含有放射性标记氨基酸的培养基中培养酵母细胞,使该聚合酶被标记。 将添加识别表位的酵母 RNA 聚合酶 II 与其抗体进行免疫共沉淀反应,使 RNA 聚合酶与其它杂质蛋白分离,一步获得高纯度的酶。加入强去污剂 SDS 使聚合 酶中各个亚基分离变性。凝胶电泳检测变性的聚合酶亚基,获得电泳图。 13.13.在在 RNARNA 聚合酶聚合酶 II II 的催化活性中心有多少个的催化活性中心有多少个 MgMg 离
14、子参与催化反应?为什么离子参与催化反应?为什么 在酵母在酵母 RNARNA 聚合酶聚合酶 II II 的晶体中只检测到一个的晶体中只检测到一个 MgMg 离子的存在?离子的存在? 答:RNA 聚合酶 II 的催化活性中心结合两个 Mg 离子,一个信号较弱。信号强 的 Mg 离子与活性中心结合紧密; 弱的离子结合松散, 可能参与结合核苷酸底物, 因此酶晶体中检测不到。 14.RNA14.RNA 聚合酶的盖、舵及叉环(聚合酶的盖、舵及叉环(fork loopfork loop)的功能?)的功能? 答:Rpb1 的盖结构与 DNA-RNA 杂交分子作用,使新形成的 8 个碱基杂交分子 之前的 DNA
15、-RNA 杂交分子发生解离。然后保持 RNA 单链的解离状态。Rpb1 的舵结构与盖配合作用,通过与-9 和-10 碱基相互作用而保持杂交分子的解离。 Rpb2的环结构通过与 RNA 的-5,-6, 和-7位相互作用而保持DNA-RNA的杂交状 态。 15.RNA15.RNA 聚合酶聚合酶 II II 的的 A A 位点和位点和 E E 位点有何功能?位点有何功能? 答:E 位点是核糖核苷酸的进入位点,A 位点是磷酸二酯键的形成位点。 16.16.接头扫描突变的原理和过程接头扫描突变的原理和过程。 答:原理:在 DNA 上用已知无启动子活性的短 DNA 片段替换原有片段,根据 其转录活性变化与
16、否来判断启动子的位置。 过程:在 DNA 上进行单一位点限制酶切割,造成缺口并消化缺口两端,使酶切 位点附近缺失 10bp 左右的核苷酸, 然后用已知无启动子活性的 10bp 的接头接入 切割为点,观察其转录活性,从而判断所切位点是否具有启动子活性。 17.17.分别说明分别说明 I I 类、类、II II 类和类和 IIIIII 类启动子的特点。类启动子的特点。 答:I 类启动子的特点:其在物种之间的保守性不高,但基本结构比较保守,具 有两个元件:核心启动子(位于转录起始位点附近)和上游启动元件,这二者之 间隔距离对于起始转录效率的影响很大, 而序列的删除比插入更易影响启动子的 起始转录效率
17、。I 类启动子为一双元启动子,UBF 结合于上游的 UPE 增加了核 心结合因子于核心启动子的结合,从而使 RNA 聚合酶 I 定位于转录起始点。这 些元件在转录起始过程中的作用都是至关重要的。 II 类启动子的特点:主要分两大部分,核心启动子和上游启动原件,其中核心启 动子又可分为 4 大部分,BRE(TFIIB 识别元件),TATAbox,起始子和下有启动 子元件;这四部分中即使缺失一个或几个,其仍具有正常的功能。下有启动子元 件可以取代 TATAbox,这两个元件很少同时出现在同一个启动子中。上游启动 子元件具有方向非依赖性而位置依赖性。 III 类启动子的特点:其主要存在于 5srRN
18、A 和 tRNA 编码基因的上游。其拥有两 种启动子,上游启动子和下游启动子。上游启动子包含 3 个短的共有序列,可以 被转录因子结合。下有启动子又称内部启动子,位于转录区的内部,可以诱发上 游一定距离的转录起始。 18.18.试说明试说明 II II 类前起始复合物中,聚合酶、启动子、类前起始复合物中,聚合酶、启动子、TBPTBP 及及 TFIIB,TFIIE,TFIIF,TFIIHTFIIB,TFIIE,TFIIF,TFIIH 的相互作用关系。的相互作用关系。 答:TBP 和 8-10 个拷贝的 TAFIIs 组成 TFIID,TFIID 在 TFIIA 的帮助下结合于 TATAbox,形
19、成 DA 复合体。紧接着 TFIIB 结合于之上形成 DAB 复合体,TFIIF 帮助 RNA 聚合酶结合于 DNA 链上的-34 到+17 之间,形成 DABPolF 复合体。 最后 TFIIE,TFIIH 依次结合形成完整的转录起始前复合体 DABPolFEH。 19.19.说明前起始复合物与三类无说明前起始复合物与三类无 TATATATA 盒启动子的结合,区分每种情况的组装因盒启动子的结合,区分每种情况的组装因 子。子。 答:三类无 TATA 盒启动子,其组装因子的区别主要是利用的 TAFII 不同: 第一种,启动子区只包含起始子,启动子的识别除 TBP 外还需要 TAFII250 和
20、TAFII150,来帮助 TBP 识别并结合起始子。 第二种,启动子区只包含起始子和 DPE,启动子的识别除 TBP 外同样也还需要 TAFII250 和 TAFII150,来帮助 TBP 识别并结合起始子和 DPE。 第三种,只有上游启动元件 GC 区,与以上两种不同的是除了前两种 TAFII 多了 一个 TAFII110,TAFII110 识别 GC 区, 而 TAFII110 通过 TAFII250 和 TAFII150 与 TBP 结合。 20.20.如何知道如何知道 TFIIIATFIIIA 对对 5S rRNA5S rRNA 基因而非基因而非 tRNAtRNA 基因的转录是必需的?
21、基因的转录是必需的? 答:TFIIIA 含有 9 个锌指排成一行,可以插入 5S rRNA 启动子任一边的大沟内, 形成紧密的蛋白质-DNA 复合物,从结构上说明了 TFIIIA 对 5S rRNA 启动子会 产生影响。另根据电泳分析,利用抗 TFIIIA 的抗体对聚合酶 III 转录的影响进行 分析。 加入抗体前可以清楚的观察到细胞提取物中tRNA和5SrRNA的特征条带, 说明二者皆正常表达;然而当加入抗体后仍然有tRNA 的条带,说明tRNA 仍然 可以被正常转录,而 5S rRNA 的条带消失了,由此说明 TFIIIA 对 5S rRNA 基因 而非 tRNA 基因的转录是必需的。 2
22、1.21.分析题:已知蛋白质分析题:已知蛋白质 X X 和和 Y Y 相互作用,如何定位蛋白质相互作用,如何定位蛋白质 X X 与与 Y Y 作用的具体作用的具体 区域?区域? 答: 当你确定了两个蛋白质分子之间有相互作用后,利用酵母双杂交技术可以精 细研究蛋白质分子中那些结构起结合调节作用。 你可以先把一个蛋白进行随机缺 失,制备一系列缺失体,然后来检测这些缺失体与另一个蛋白质结合力的大小, 直到发现在蛋白质两两分子间起决定作用的氨基酸序列(称为结构域或motif)。 如果一个蛋白分子中具有已知的结构域或motif,也一样进行缺失,看是否这些 已知的结构域或motif参与结合调节作用。然而,
23、某些氨基酸序列的缺失可能导 致其空间结构的改变,而导致二者无法结合,即虽然缺失的氨基酸不是二者相互 作用的区域, 但由于这些氨基酸的缺失导致蛋白空间结构发生改变,使活性区域 被包埋或无法形成促进结合的空间构象,从而出现假阳性。为了克服以上弊端, 我们可以用计算机对缺失突变后的序列进行空间构象的模拟预测, 并把它与蛋白 的天然构想进行比对,进一步验证缺失突变的结果。 22.22.列举真核激活因子列举真核激活因子 3 3 类不同的类不同的 DNADNA 结合域和结合域和 3 3 类不同的转录激活域类不同的转录激活域 答:DNA 结合域: (1)螺旋-转折-螺旋结构,这一类蛋白质分子中有至少两个螺旋
24、,中间由短侧 链氨基酸残基形成“转折”,近羧基端的螺旋中氨基酸残基的替换会影响该蛋 白质在 DNA 双螺旋大沟中的结合。 (2)锌指结构,其特有的半胱氨酸和组氨酸残基之间氨基酸残基数基本恒定, 有锌参与时才具备转录调控活性。重复的锌指样结构都是一个螺旋与一个反向 平行的片层的基部以锌原子为中心,通过与一对半胱氨酸和一对组氨酸之间形 成配位键相连接,锌指环上突出的赖氨酸、精氨酸参与 DNA 的结合。 (3)碱性亮氨酸拉链,一般在蛋白的羧基端35 个氨基酸残基具有能形成螺旋 的特点, 其中每隔 6 个氨基酸就有一个亮氨酸残基,这就导致第 7 个亮氨酸残基 都在螺旋的同一方向出现,这是其形成二聚体的
25、基础。通过形成二聚体,其使肽 链氨基端 20-30 个富含碱性氨基酸的结构域与 DNA 结合。在没有形成二聚体的 情况下这 20-30 个氨基酸与 DNA 的结合能力很低。 转录激活结构域:转录激活结构域: (1)带负电荷的螺旋结构,这种酸性螺旋结构特异性诱导转录起始的活性并不 是很强,他们可能与 TFIID 复合物中某个通用因子或 RNA 聚合酶 II 本身结合, 并有稳定转录起始复合物的作用。 (2)富含谷氨酰胺的结构,如 SP1 是启动子 GC 盒的结合蛋白,除结合 DNA 的锌指结构以外,SP1 共有 4 个参与转录活化的区域,其中最强的转录活化域很 少有极性氨基酸,却富含谷氨酰胺,达
26、该区氨基酸总数的 25%左右。 (3) 富含脯氨酸的结构域, 如 CTF-NF1 因子, 其羧基端富含脯氨酸, 达 20%-30% 左右。 23.23.染色体结构、组成与基因表达染色体结构、组成与基因表达 答:结构:所谓染色体,DNA 与组蛋白 H2A,H2B,H3,H4 各两个组成的八聚体核 心以一定规律盘绕后形成核小体,众多核小体组成染色质细丝,进一步压缩形成 螺线管状结构,再进一步压缩成超螺旋,最后一步压缩形成染色体,总压缩倍数 接近 1 万倍。大量非组蛋白亦结合于染色体上,功能各异。 组成:染色体包括 DNA 和蛋白质两大部分。蛋白质部分又可分为组蛋白和非组 蛋白,组蛋白是染色体的结构
27、蛋白,它与 DNA 组成核小体。经过多级盘绕形成 紧凑的染色体结构。非组蛋白则包括如下几种:高速泳动蛋白,其作用可能与 DNA 的超螺旋结构有关;DNA 结合蛋白,它们可能是一些与 DNA 复制或转录 有关的酶或调节物质;A24 非组蛋白,其功能不详。 基因表达:进行基因表达时,核小体组蛋白的 N 端经乙酰化等修饰,使得 DNA 暂时脱离组蛋白的束缚,从而在 RNA 聚合酶和转录因子组成的复合物的作用下 进行基因表达,之后组蛋白去乙酰化,DNA 与组蛋白重新形成核小体。染色体 上存在一些异染色区,这些区域高度压缩,其中的DNA 已经失去了基因表达的 活性,无法表达基因产物。 24.24.绝缘子的结构与功能绝缘子的结构与功能 答:结构特点:
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