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文档简介

1、硫酸软骨素质量标准硫酸软骨素质量标准硫酸软骨素质量标准硫酸软骨素质量标准 及含量测定及含量测定 青岛大学药学系青岛大学药学系 高华高华高华高华 一、硫酸软骨素结构一、硫酸软骨素结构 硫酸软骨素硫酸软骨素是种是种?硫酸软骨素硫酸软骨素(Chondroitin Sulfate,CS),是是一一种种 重要的天然重要的天然酸性粘多糖酸性粘多糖。重要的天然重要的天然酸性粘多糖酸性粘多糖 ?硫酸软骨素是由硫酸软骨素是由D-葡糖醛酸和葡糖醛酸和N-乙酰基乙酰基-D-氨基氨基 半乳糖以半乳糖以-1,3糖苷键结合而成的双糖,而双糖糖苷键结合而成的双糖,而双糖 之间以之间以-1 4苷键连接而成生物大分子苷键连接而

2、成生物大分子。之间以之间以-1,4苷键连接而成生物大分子苷键连接而成生物大分子。 ?CS相对分子质量一般为相对分子质量一般为500050000Da。 ?根据硫酸基在半乳糖上位置不同主要分为根据硫酸基在半乳糖上位置不同主要分为硫酸硫酸 软骨素软骨素硫酸软骨素硫酸软骨素软骨素软骨素A(CSA)硫酸软骨素硫酸软骨素C (CSC) 硫酸软骨素结构硫酸软骨素结构 ?根据硫酸基在半乳糖上位置不同主要分为根据硫酸基在半乳糖上位置不同主要分为 硫酸软骨素硫酸软骨素A (CSA)和和硫酸软骨素硫酸软骨素C (CSC) 硫酸软骨素A(CSA)硫酸软骨素C(CSC)硫酸软骨素A(CSA)硫酸软骨素C(CSC) 硫酸

3、基团在半乳糖的第4位C上硫酸基团在半乳糖的第6位C上硫酸基团在半乳糖的第4位C上硫酸基团在半乳糖的第6位C上 二二硫酸软骨素存在形式硫酸软骨素存在形式二二、硫酸软骨素存在形式硫酸软骨素存在形式 ?ChS的来源有陆产动物和海洋动物两大类。陆产动ChS的来源有陆产动物和海洋动物两大类。陆产动 物主要是牛物主要是牛、猪猪、羊羊和禽和禽等软骨组织中等软骨组织中,如喉骨如喉骨、物主要是牛物主要是牛、猪猪、羊羊和禽和禽等软骨组织中等软骨组织中,如喉骨如喉骨、 鼻中骨、气管、血管壁等,主要成分鼻中骨、气管、血管壁等,主要成分4-硫酸软骨硫酸软骨 素素 (CSA) 。海洋动物包括软骨鱼的软骨、海参和。海洋动物

4、包括软骨鱼的软骨、海参和 贝类等贝类等主要成分主要成分6 硫酸软骨素硫酸软骨素 (CSC)贝类等贝类等,主要成分主要成分6-硫酸软骨素硫酸软骨素 (CSC)。 ?软骨中的硫酸软骨素与蛋白质相结合以软骨中的硫酸软骨素与蛋白质相结合以蛋白多糖蛋白多糖 的形式存在的形式存在组织中。组织中。 三、硫酸软骨素质量标准三、硫酸软骨素质量标准 ?USP32-美国药典美国药典29版版 硫酸软骨素硫酸软骨素(牛牛、猪猪、鸡鸡、鲨鱼鲨鱼)硫酸软骨素硫酸软骨素(牛牛、猪猪、鸡鸡、鲨鱼鲨鱼) ?JPC1997 -日本药局方外标准日本药局方外标准(1997) 硫酸软骨素硫酸软骨素(牛牛猪猪鲨鱼鲨鱼)硫酸软骨素硫酸软骨素

5、(牛牛、猪猪、鲨鱼鲨鱼) ?WS-10001-(HD-0894)-2002硫酸软骨素硫酸软骨素A 钠钠 硫酸软骨素硫酸软骨素(供注射用供注射用)?WS-10001-(HD-0892)-2002 硫酸软骨素硫酸软骨素(供注射用供注射用) ?WS-10001-(HD-0895)-2002 硫酸软骨素A钠胶囊 WS-10001-(HD-0896)-2002 硫酸软骨素滴眼液 WS-10001-(HD-0854)-2002 复方硫酸软骨素片 硫酸软骨素硫酸软骨素(USP32/JPC1997)硫酸软骨素硫酸软骨素(USP32/JPC1997) ?外观外观:白色白色至至乳白色乳白色?来源来源:牛牛、猪猪、

6、鸡软骨鸡软骨 硫酸软骨素钠硫酸软骨素钠90% 澄清度澄清度无色透明无色透明 外观外观白色乳白色白色乳白色 ?理化指标理化指标 来源来源牛牛猪猪鸡软骨鸡软骨 硫酸软骨素钠硫酸软骨素钠:90% 澄清度澄清度:无色透明无色透明 pH值值(1%溶液溶液):5.57.5 干燥失重:干燥失重:10.0% 氯化物氯化物硫酸盐硫酸盐氯化物氯化物:0.142% 硫酸盐硫酸盐:0.240% 重金属:重金属:20 mg/kg 积灼残渣:积灼残渣:23.030.0% 旋光度:旋光度:-28-32氮含量:氮含量:2.53.8% ?微微生生物指标物指标 细菌总数:细菌总数:100 CFU/g 霉菌和酵母:霉菌和酵母:10

7、 CFU/g 沙门氏菌沙门氏菌,大肠杆菌大肠杆菌,葡萄球菌葡萄球菌,致病菌致病菌:不得检出不得检出 微物指标微物指标 沙门氏菌沙门氏菌,大肠杆菌大肠杆菌,葡萄球菌葡萄球菌,致病菌致病菌:不得检出不得检出 硫酸软骨素硫酸软骨素(USP32/JPC1997)硫酸软骨素硫酸软骨素(USP32/JPC1997) ?外观外观:白色白色至至乳白色乳白色?来源来源:鲨鲨鱼鱼软骨软骨 硫酸软骨素钠硫酸软骨素钠90% 澄清度澄清度无色透明无色透明 外观外观白色乳白色白色乳白色 ?理化指标理化指标 来源来源鲨软骨鲨软骨 硫酸软骨素钠硫酸软骨素钠:90% 澄清度澄清度:无色透明无色透明 pH值值(1%溶液溶液):5

8、.57.5 干燥失重:干燥失重:10.0% 氯化物氯化物硫酸盐硫酸盐氯化物氯化物:0.142% 硫酸盐硫酸盐:0.240% 重金属:重金属:20 mg/kg 积灼残渣:积灼残渣:23.030.0% 旋光度:旋光度:-12-18氮含量:氮含量:2.53.8% ?微微生生物指标物指标 细菌总数细菌总数:100 CFU/g 霉菌和酵母霉菌和酵母:10 CFU/g 沙门氏菌沙门氏菌,大肠杆菌大肠杆菌,葡萄球菌葡萄球菌,致病菌致病菌:不得检出不得检出 微物指标微物指标 沙门氏菌沙门氏菌,大肠杆菌大肠杆菌,葡萄球菌葡萄球菌,致病菌致病菌:不得检出不得检出 WS-10001-(HD-0894)-2002 硫

9、酸软骨素硫酸软骨素A 钠钠 外外白色或微黄色白色或微黄色 来源来源猪软骨猪软骨 ?外外观观:白色或微黄色白色或微黄色 ?理化指标理化指标 ?来源来源:猪软骨猪软骨 硫酸软骨素钠:硫酸软骨素钠:90% 澄清度:无色透明澄清度:无色透明 pH值值(1%溶液溶液):5.57.5 干燥失重干燥失重:5.0% pH值值(1%溶液溶液):5.57.5 干燥失重干燥失重:5.0% 硫酸盐: 硫酸盐:与标准硫酸钾溶液与标准硫酸钾溶液5.0ml对照液比较,不得更浓对照液比较,不得更浓(0.5%) 重金属重金属:20 mg/kg 平均分子量平均分子量:35000-5000 重金属重金属:20 mg/kg 平均分子

10、量平均分子量:35000 5000 旋光度:旋光度:-27 -33氮含量:氮含量:2.23.8% 微生物指标微生物指标 细菌总数细菌总数:1000 CFU/g 霉菌和酵母霉菌和酵母:100 CFU/g ?微生物指标微生物指标 沙门氏菌,大肠杆菌,葡萄球菌,致病菌:不得检出沙门氏菌,大肠杆菌,葡萄球菌,致病菌:不得检出 WS-10001-(HD-0892)-2002 硫酸软骨素(供注射用)硫酸软骨素(供注射用) 外外白色或微黄色白色或微黄色 来源来源猪软骨猪软骨 ?外外观观:白色或微黄色白色或微黄色 ?理化指标理化指标 ?来源来源:猪软骨猪软骨 硫酸软骨素钠:硫酸软骨素钠:90% 澄清度澄清度(

11、5%溶液溶液): A640nm0.05 pH值值(1%溶液溶液):5.57.5 干燥失重干燥失重:10.0% pH值值(1%溶液溶液):5.57.5 干燥失重干燥失重:10.0% 硫酸盐: 硫酸盐:与标准硫酸钾溶液与标准硫酸钾溶液5.0ml对照液比较,不得更浓对照液比较,不得更浓(0.5%) 重金属重金属:20 mg/kg 氯化物氯化物:1 0%重金属重金属:20 mg/kg 氯化物氯化物:1.0% 旋光度:旋光度:-27 -33氮含量:氮含量:2.53.8% 微生物指标微生物指标 细菌总数细菌总数:1000 CFU/g 霉菌和酵母霉菌和酵母:100 CFU/g ?微生物指标微生物指标 沙门氏

12、菌,大肠杆菌,葡萄球菌,致病菌:不得检出沙门氏菌,大肠杆菌,葡萄球菌,致病菌:不得检出 四、硫酸软骨素含量测定方法四、硫酸软骨素含量测定方法 ?各个国家对各个国家对CS含量测定方法不尽相同。含量测定方法不尽相同。 ?对几个主要国家对几个主要国家CS含量测定方法进行介绍。含量测定方法进行介绍。 ?对目前精确度专属性较好的一些方法进行比对目前精确度专属性较好的一些方法进行比 较,并对较,并对CS含量测定方法进行评价。含量测定方法进行评价。 1.Elson-Morgan法法1. Elson Morgan法法 ?该法主要用于测定该法主要用于测定CS,包括包括CS片片、CS(供注射用供注射用)、该法主要

13、用于测定该法主要用于测定,包括包括片片、(供注射用供注射用)、 CS注射液、注射液、CS滴眼液、复方滴眼液、复方CS片等。片等。 方法原理方法原理供试品先用供试品先用6l/L盐酸加热水解生成盐酸加热水解生成?方法原理方法原理:供试品先用供试品先用6 mol/L盐酸加热水解生成盐酸加热水解生成 氨基已糖,然后在碱性条件下与乙酰丙酮反应,氨基已糖,然后在碱性条件下与乙酰丙酮反应, 生成色原物质,再与对二甲氨基苯甲醛溶液反应 产生红色。以 生成色原物质,再与对二甲氨基苯甲醛溶液反应 产生红色。以氨氨基葡基葡糖糖为对为对照照品,用分光光度法品,用分光光度法氨糖照氨糖照 在在525 nm波长处测吸光度,

14、乘以系数波长处测吸光度,乘以系数0.8309计算计算 氨基葡糖的量氨基葡糖的量氨基葡糖的量氨基葡糖的量。 ?该法不仅不能准确测定该法不仅不能准确测定CS的主体结构的真实含量,的主体结构的真实含量, 而且结果重现性不好。而且结果重现性不好。 2.咔唑分光光度法2.咔唑分光光度法 ?该法主要用于测定该法主要用于测定CS-A钠。包括钠。包括CS-A钠胶囊等。钠胶囊等。 方法原理方法原理硫酸软骨素在酸性溶液中水解生成硫酸软骨素在酸性溶液中水解生成D?方法原理方法原理:硫酸软骨素在酸性溶液中水解生成硫酸软骨素在酸性溶液中水解生成D- 葡萄糖醛酸和葡萄糖醛酸和N-乙酰乙酰-D-氨基半乳糖。本方法是基氨基半

15、乳糖。本方法是基 于于CS溶液中加热水解生成等摩尔数的葡萄糖醛酸,溶液中加热水解生成等摩尔数的葡萄糖醛酸, 与咔唑溶液发生缩合反应生成紫红色化合物与咔唑溶液发生缩合反应生成紫红色化合物。与咔唑溶液发生缩合反应生成紫红色化合物与咔唑溶液发生缩合反应生成紫红色化合物 ?CS中的葡糖醛酸在饱和硼酸溶液和四硼酸钠硫酸中的葡糖醛酸在饱和硼酸溶液和四硼酸钠硫酸 溶液的作用下加热生成糠醛溶液的作用下加热生成糠醛在在0 2咔唑无水乙咔唑无水乙溶液的作用下加热生成糠醛溶液的作用下加热生成糠醛,在在0.2咔唑无水乙咔唑无水乙 醇溶液中加热显红色,在醇溶液中加热显红色,在520 nm波长有最大吸收。波长有最大吸收。

16、 2. 咔唑分光光度法咔唑分光光度法 ?测定时以葡糖醛酸为对照品。测定时以葡糖醛酸为对照品。 ?该法准确度有所提高该法准确度有所提高但专属性仍然不是很好但专属性仍然不是很好?该法准确度有所提高该法准确度有所提高。但专属性仍然不是很好但专属性仍然不是很好。 ?测定时先水解后显色。对产品中掺入葡萄糖醛测定时先水解后显色。对产品中掺入葡萄糖醛 酸造成测定结果偏高的问题无法解决,该法测酸造成测定结果偏高的问题无法解决,该法测 定耗时定耗时因使用浓硫酸给测定操作带来不便因使用浓硫酸给测定操作带来不便定耗时定耗时,因使用浓硫酸给测定操作带来不便因使用浓硫酸给测定操作带来不便。 ?该法不用大型仪器该法不用大

17、型仪器,准确度较高准确度较高,重现性和稳重现性和稳该法不用大型仪器该法不用大型仪器,准确度较高准确度较高,重现性和稳重现性和稳 定性好,适用于中小型企业CS产品测定。定性好,适用于中小型企业CS产品测定。 3. 浊度分光光度法浊度分光光度法 ?本方法是利用硫酸软骨素可与氯化十六烷基吡啶本方法是利用硫酸软骨素可与氯化十六烷基吡啶 缔合生成稳定乳浊液的性质缔合生成稳定乳浊液的性质建立的建立的CS浊度分光浊度分光缔合生成稳定乳浊液的性质缔合生成稳定乳浊液的性质,建立的建立的CS浊度分光浊度分光 光度测定法。光度测定法。 ?样品不需水解可直接测定样品不需水解可直接测定, 因而简便快速。因而简便快速。

18、?由于该方法测定结果偏高及由于该方法测定结果偏高及CSCS澄清度影响测定结澄清度影响测定结?由于该方法测定结果偏高及由于该方法测定结果偏高及CSCS澄清度影响测定结澄清度影响测定结 果,故适用于澄清度较高的CS测定及生产企业粗果,故适用于澄清度较高的CS测定及生产企业粗 略快速检测略快速检测的需要的需要略快速检测略快速检测CSCS的需要的需要。 4 CPC电位滴定法电位滴定法4. CPC电位滴定法电位滴定法 -氯化十六烷基吡啶(氯化十六烷基吡啶(cetylpyridinium chloride, CPC) ?该法主要用于测定原料及产品等。该法主要用于测定原料及产品等。 ?方法原理:方法原理:C

19、S为聚阴离子,可与为聚阴离子,可与CPC结合,在适结合,在适 宜条件下生成稳定的乳浊液宜条件下生成稳定的乳浊液与与CS对照品溶液比对照品溶液比宜条件下生成稳定的乳浊液宜条件下生成稳定的乳浊液,与与CS对照品溶液比对照品溶液比 较混悬液的透光度。可知检测物的含量。较混悬液的透光度。可知检测物的含量。 ?该法实验的影响因素少、便于操作。但其他酸性该法实验的影响因素少、便于操作。但其他酸性 粘多糖也有类似的沉淀反应粘多糖也有类似的沉淀反应专属性不好专属性不好粘多糖也有类似的沉淀反应粘多糖也有类似的沉淀反应,专属性不好专属性不好。 4. CPC电位滴定法电位滴定法测定步骤测定步骤 ?测定时,以含聚山梨

20、醇酯测定时,以含聚山梨醇酯80的的pH 7.0磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液 作为稀释液作为稀释液。作为稀释液作为稀释液 ?将将CS对照品稀释为约对照品稀释为约1.5, 1.0, 0.5 mg/mL三种标准溶三种标准溶 液液各取各取5 0 mL分置分置3个滴定容器中个滴定容器中用用CPC溶溶液液。各取各取5.0 mL,分置分置3个滴定容器中个滴定容器中。用用CPC溶溶 液进行光度滴定。液进行光度滴定。 在在420550或或660波长处测定波长处测定滴定前将仪器设滴定前将仪器设?在在420,550或或660 nm波长处测定波长处测定。滴定前将仪器设滴定前将仪器设 置成吸光度为置成吸光度为0。用所取标准

21、溶液含。用所取标准溶液含CS毫克数及消毫克数及消 耗耗体积作回归方程体积作回归方程耗耗CPC体积作回归方程体积作回归方程。 ?另取供试液另取供试液5.0 mL。同法测定。计算。同法测定。计算CS的百分含量。的百分含量。 5. 高效液相色谱法高效液相色谱法(HPLC) ?通过色谱柱分离后定量测定CS含量,同时可检测通过色谱柱分离后定量测定CS含量,同时可检测 CSCS产品纯度产品纯度CSCS产品纯度产品纯度。 ?该法专属性强、精密度和准确度较高,样品溶解该法专属性强、精密度和准确度较高,样品溶解 可直接测定CS含量以及确定CS纯度。可直接测定CS含量以及确定CS纯度。 需的仪贵需的仪贵该方法适用

22、科单位该方法适用科单位?但因但因需需要要的仪的仪器昂器昂贵贵,该方法适用该方法适用于于科科研研单位单位、 商检部门及商检部门及生生产企产企业业鉴定鉴定CSCS产品纯度和含量测定产品纯度和含量测定。商检部门及产企鉴定商检部门及产企鉴定产品纯度和含量测定产品纯度和含量测定 6 酶解酶解 高效液相色谱法高效液相色谱法6. 酶解酶解-高效液相色谱法高效液相色谱法 -中国药典中国药典2010年版方法年版方法 ?方法原理:方法原理:CS钠在硫酸软骨素钠在硫酸软骨素ABC酶作用下,酶作用下, 酶解为三种不饱和的二糖酶解为三种不饱和的二糖用强阴离子交换硅用强阴离子交换硅酶解为三种不饱和的二糖酶解为三种不饱和的

23、二糖用强阴离子交换硅用强阴离子交换硅 胶为填充剂,以水胶为填充剂,以水(用稀盐酸调节用稀盐酸调节pH值至值至3.5)为为 流动相流动相A以以2 l/LN Cl溶液溶液(用稀盐酸调节用稀盐酸调节 H流动相流动相A,以以2 mol/LNaCl溶液溶液(用稀盐酸调节用稀盐酸调节pH 值至值至3.5)为流动相为流动相B,进行线性梯度洗脱。流速,进行线性梯度洗脱。流速 为为1.0 mL/min,检测波长为,检测波长为232 nm。 ?用用CS钠对照品作为对照钠对照品作为对照,按外标法以按外标法以3种不饱种不饱?用用CS钠对照品作为对照钠对照品作为对照,按外标法以按外标法以3种不饱种不饱 和二糖的面积之和

24、计算,即得。和二糖的面积之和计算,即得。 该法准确度该法准确度精确度精确度专属性都很好专属性都很好?该法准确度该法准确度、精确度精确度、专属性都很好专属性都很好。 6 酶解酶解 高效液相色谱法高效液相色谱法6. 酶解酶解-高效液相色谱法高效液相色谱法 ?各种软骨素酶各种软骨素酶,如如chondroitinase ABC的发现和应的发现和应?各种软骨素酶各种软骨素酶,如如chondroitinase ABC的发现和应的发现和应 用,为用,为CS多糖的定性和定量,尤其为不同来源多糖的定性和定量,尤其为不同来源CS 细微结构分析提供了重要基础细微结构分析提供了重要基础细微结构分析提供了重要基础细微结

25、构分析提供了重要基础。 ?通过采用组合酶解技术,得到结构不同的二糖,通过采用组合酶解技术,得到结构不同的二糖, 再用高效离子色谱法或者高效液相色谱法。再用高效离子色谱法或者高效液相色谱法。 ?对各种对各种二二糖进行定量分析糖进行定量分析,可以准确地确定多糖可以准确地确定多糖对各种糖进行定量分析对各种糖进行定量分析,可以准确地确定多糖可以准确地确定多糖 的结构类型及其比例。的结构类型及其比例。 该方法尤其适合该方法尤其适合CS钠钠(口服口服)CS钠片钠片CS钠胶囊钠胶囊?该方法尤其适合该方法尤其适合CS钠钠(口服口服)、CS钠片钠片、CS钠胶囊钠胶囊 等制剂中的等制剂中的CS分析,并已经作为硫酸

26、软骨素质量分析,并已经作为硫酸软骨素质量 控制的理想方法之控制的理想方法之控制的理想方法之控制的理想方法之一。一。 其他国家CS测定方法其他国家CS测定方法 ?我国的我国的CS主要出口到美国、英国、其它欧盟主要出口到美国、英国、其它欧盟 国家等。这些国家是药品生产技术比较先进、国家等。这些国家是药品生产技术比较先进、 药品质量控制比较完善的国家药品质量控制比较完善的国家药品质量控制比较完善的国家药品质量控制比较完善的国家。 ?CS在这些国家的使用有所不同在这些国家的使用有所不同,因此质量控因此质量控在这些国家的使用有所不同在这些国家的使用有所不同因此质量控因此质量控 制也各有侧重。制也各有侧重

27、。 美国美国CS测定测定-CPC法法 ?美国美国是美国美国是CS的消费大国,主要用为膳食补充剂。的消费大国,主要用为膳食补充剂。 CS为聚阴离子为聚阴离子可与可与 CPC结合结合在适宜条件下在适宜条件下?CS为聚阴离子为聚阴离子,可与可与 CPC结合结合,在适宜条件下在适宜条件下 生成稳定的乳浊液,与生成稳定的乳浊液,与CS对照品溶液比较混悬液对照品溶液比较混悬液 的透光度。可知检测物的含量。的透光度。可知检测物的含量。 该法实验的影响因素少该法实验的影响因素少便于操作便于操作但其他酸性但其他酸性?该法实验的影响因素少该法实验的影响因素少、便于操作便于操作。但其他酸性但其他酸性 黏多糖也有类似

28、的沉淀反应,专属性不好。黏多糖也有类似的沉淀反应,专属性不好。 英国英国CS测定测定-CPC法法 ?原理与美国药典相同,具体操作稍有差异。原理与美国药典相同,具体操作稍有差异。 ?测定时测定时,取取CS对照品溶液对照品溶液(1 0 mg/mL)和供试品和供试品?测定时测定时,取取CS对照品溶液对照品溶液(1.0 mg/mL)和供试品和供试品 溶液溶液(1.0 mg/mL)各各5.0 mL,分别转移至单独的,分别转移至单独的 滴定容器中滴定容器中加水稀释至加水稀释至50 mL调滴定仪于调滴定仪于555滴定容器中滴定容器中。加水稀释至加水稀释至50 mL,调滴定仪于调滴定仪于555 nm波长处空白溶液的透光率为波长处空白溶液的透光率为100。分别用。分别用 CPC溶液进行滴定溶液进行滴定滴定至浑浊最大值滴定至浑浊最大值曲线下曲线下CPC溶液进行滴定溶液进行滴定,滴定至浑浊最大值滴定至浑浊最大值。曲线下曲线下 降的最快点即为终点。降的最快点即为终点。

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