现代分析测试技术 光学显微技术.ppt

1、第二章 光学显微技术,1,12世纪初，阿尔海真磨制透镜。 1590年， 詹森父子就制造出第一台放大倍数约为20倍的显微镜。 1610年意大利物理学家伽利略制造了具有物镜、目镜及镜筒的复式显微镜。 1611年开普勒阐明了显微镜的基本原理。 1625年，法布尔首先提出“显微镜”一词。 1628年前后舒纳在开普勒设计的基础上制造出近代显微镜。,2.1 光学显微镜的发展历程,2,1665年，罗伯特胡克制造复式显微镜，140倍，观察细胞。 1684年，荷兰物理学家惠更斯设计并制造出结构简单的双透镜目镜-惠更斯目镜，是现代多种目镜的原型。已初具现代显微镜的基本结构。,3,19世纪70年代， 德国的物理学家

2、、数学家恩斯特阿贝提出了完善的显微镜理论，阐明了成像原理、数值孔径等问题，对显微镜发展的贡献最为卓著。 * 20世纪中叶，人们采用短波长的光线作光源制造出荧光显微镜和紫外光显微镜，由于光源波长的缩短而提高了显微镜的分辨本领。,4,2.2 光学显微镜的成像原理,2.2.1 衍射的形成-光波相互之间的干涉作用,如果照明光线为平行光，在狭缝中间连线上的每一点可以看作是一个光源，发射子波，由于这些子波相互之间的干涉作用，光的能量分布变得不再均匀。,5,屏幕上的P1点到狭缝上边缘的距离和它到狭缝下边缘的距离之差为一个波长。 连线b上发出其他任意两列光波到达点的波程差均小于一个波长。 狭缝上缘处发出的一个

3、子波，和狭缝中央下方且紧邻着的点发出的第二个子波，二者波程差为半个波长，此时发生相干抵消。造成P1 点位于光强的谷底。,6,叠加效果,屏幕上的P2 点到狭缝上边缘的距离和它到狭 缝下边缘的距离之差为3/2波长。此点位于相干增强中心，为第一级衍射放大值。 第二、第三和更高级的衍射极大值发生在波程差为半波长的奇数倍处，而相干极小值发生在波程差为半波长的偶数倍处。,7,由于衍射效应，一个点光源在像平面上将形成一个具有一定尺寸的中央亮斑及其周围明暗相间的圆环所组成的所谓埃利斑。 通常以埃利斑第一暗环的半径来衡量其大小。埃利斑约84%的强度集中在中央亮斑，其余则分散在第一亮环、第二亮环。由于周围亮环光强

4、度比较低，一般情况肉眼不易分辨，只能看到中央亮斑。,8,点光源通过透镜产生的埃利斑第一暗环半径R0为,埃利斑半径与照明光源波长成正比，与透镜 nsin值（数值孔径） 成反比。,9,n：透镜物方介质折射率； ：为照明光波长； ：为透射孔径半角； M：为透镜放大倍数,2.2.2 阿贝衍射成像原理,当物质小至可与光波的波长相比较时，不能把光线看成是直线传播，而要考虑衍射效应； 显微镜中的光线总是部分相干的，因此显微镜的成像过程是个衍射相干过程。,10,德国物理学家阿贝最先用光的衍射相干涉理论解释了透射光显微镜的成像过程，与点光源衍射的区别在于成像的过程包括很多点光源的干涉效应。,衍射（散射）光干涉条

5、件：,11,平行衍射光束经透镜后会在物镜后焦面上会聚，产生衍射花样-夫琅和费衍射花样。 k=0，光程差为0，为直射光，聚焦在主轴上，为0级衍射斑-焦点。 衍射斑点是由不同物点的散射光相干加强形成的；从同一物点发出的散射光，在产生相应的衍射斑点后继续传播，在像平面上又相互干涉，形成图像，这个图像就是物像。,12,样品,物镜,后焦面,像平面,埃利斑,阿贝成像原理分为两次干涉过程：,1、平行光束遭到物的散射作用而分裂成为各级衍射谱-由物变换到衍射谱的过程； 2、各级衍射谱经过干涉重新在像平面上会聚成像点-由衍射重新变换到像(像是放大了的物)的过程。,13,物与像之间的相似性是由什么决定的呢？,物像是

6、由直射光和衍射光互相干涉形成的，不让衍射光通过就不能成像，参与成像的衍射斑点越多，则物像与物体的相似性越好。,遮蔽方法：,最终图像：,(a),(b),(c),(d),14,（遮蔽夫琅和费衍射花样的一部分）,由于衍射等因素的影响，显微镜的分辨能力和放大能力都受到一定限制。目前金相显微镜可观察的最小尺寸是200 nm，有效放大率最大为1500-1600倍。,显微镜可实现放大原因的理解：（直线传播作图解释）,15,阿贝成像原理真实地反应了光学显微镜的成像过程，但解释放大不够直观。,2.3 光学显微镜的构造和光路图,16,2.3.1 光学系统 目镜、物镜、光源、 聚光器:集中光线，包括聚光镜和孔径光阑

7、。,2.3.2 机械部分 机架：底座和弯臂 目镜筒 物镜转换器 载物台 调焦机构,17,2.4 显微镜的重要光学技术参数,显微镜的光学技术参数包括：数值孔径、分辨率、放大率、焦深、视场宽度、覆盖差、工作距离等等。这些参数并不都是越高越好，它们之间是相互联系又相互制约的。,18,2.4.1 数值孔径,数值孔径是物镜与被检物体之间介质的折射率和半孔径角的正弦之乘积。 NA是表示物镜分辨细节能力的参数，是判断物镜性能高低的重要标志。,19,孔径角越大，进入物镜的光通量就越大，分辨率就越高。 与物镜的有效直径成正比，与焦点的距离成反比。,物,根据阿贝成像原理，衍射光线反映了物体形貌的细节，因此一个物镜

8、要反映物体的细节，必须能够接受尽量多的高阶衍射光线。作为最低的要求，物镜必须能接收0级光和部分的一阶衍射极大值光线，如果能够全部接收一阶衍射光线，图像基本上不会失去细节。,孔径角的影响,20,样品的细节越微小（b的值越小）,P1会越远离P0，形成各级衍射极大值所需要的衍射角越大，越需要更大口径的物镜去接收衍射光线，过于细小的物体会形成超过物镜接收能力的一阶极大值衍射光线，将无法成像。,21,物镜接收衍射光线的能力也强烈地依赖于样品与镜头之间的介质，如空气、水、玻璃和油等。 显微镜观察时，若想增大NA 值，孔径角是无法增大的，唯一的办法是增大介质的折射值。基于这一原理，就产生了水浸物镜和油浸物镜

9、率，因介质的折射率值大于1, NA值就能大于1。 因此，数值孔径的概念更加能够有效地描述物镜的成像能力。,折射率的影响,22,2.4.2 分辨率,23,通常把两埃利斑中心间距等于第一暗环半径R0时，样品上相应的两个物点间距离r0定义为透镜能分辨的最小距离，也就是透镜的分辨本领。,24,像平面,此时，两个光斑强度峰间的强度谷值比强度峰值低19时（最大值），这个强度反差对人眼来说是刚有所感觉。也就是说，这个反差值是人眼能否感觉出存在两个斑点的临界值。,25,透镜的分辨本领（分辨率）是由物镜的NA值与照明光源的波长两个因素决定的，NA值越大，照明光线波长越短，分辨率就越高。可见光的波长在390-76

10、0 nm之间，最佳情况下，光学玻璃透镜分辨本领的理论极限可达200 nm。,26,为什么？,2.4.3 放大率和有效放大率,放大倍数 = 物镜放大倍数 目镜放大倍数,人眼的分辨本领约是0.2 mm，光学显微镜分辨本领极限大约是0.2 m。有效放大倍数为0.2 mm/0.2 m = 1000。为了减轻人眼的负担，所选用的相应的有效放大倍数略高些，根据上述原则确定光学显微镜的最高放大倍数是1000-1500倍。,27,光学显微镜必须提供足够大的放大倍数，把它能分辨的最小距离放大到人眼能分辨的程度，相应的放大倍数为有效放大倍数：,2.4.4 光学透镜的像差,通常平行于透镜光轴的光线在通过透镜后并不会聚集于一点，而是会聚成一个模糊的斑点或称弥散圈。同样，一个物体通过透镜后也不可能形成完全相似的像，图像往往发生了变形。造成这些缺陷的主要原因是透镜本身存在的各种像差。,28,一个物点散射的光束经过具有球差的磁透镜后，物像并不会聚一点，而分别会聚于轴向的一定距离上。,1. 球差 球差即球面像差，是透镜的不同部分对光有不同的会聚能力引起的。,无论像平面在什么位置，都不能得到清晰的像，而是一个弥散圆斑。,29,2. 色差 玻璃透镜对不同波长的光具有不同的焦距，即色差。,30,31,球差 ，色差，球面透镜都存在，无法消除；组合透镜进行