天然产物化学第二章.ppt

1、,第二章,天然产物的提取分离和结构鉴定,一、天然产物化学成分的预试验 基本原理是根据各成分极性的不同，先系统地分成几个不同部分，然后利用显色反应或沉淀反应，或结合纸色谱、薄板色谱，定性判断各部分中可能含有的化合物类型。 根据相似相溶的原理，极性大的成分在极性溶剂中溶解度大，极性小的成分则易溶于非极性溶剂。选择适当的溶剂，极性由小到大，或由大到小，可顺次将极性比较相近的成分分开。常用溶剂的极性次序为（由小到大）： 石油醚环己烷苯氯仿（二氯甲烷）乙醚乙酸乙酯正丁醇丙醇、乙醇甲醇水含盐水,第一节 天然产物化学成分的预试方法,表2-1 溶剂和有效成分极性相似对照,天然药材粗粉,5-10g,5-10g,

2、5-10g,加水50-100ml 浸湿1h,10倍量95 EtOH回流1h,10倍石油醚 浸提0.5h,水提液,EtOH提取液,石油醚提取液,（检查单糖、多糖、鞣质、 皂苷、aa、多肽、蛋白质）,（检查萜类、甾体、 油脂、挥发油）,回收EtOH,浓缩液,甲份,乙份,EtOH溶解,醇溶液,HCl溶液 （检测生物碱）,不溶物,EtOAc溶解,（检查鞣质、酚类、有机酸、 黄酮、蒽醌、甾体、三萜等）,EtOAC溶液,5NaOH溶液振摇,碱水液 （检查有机酸、酚类）,EtOAC液,EtOH溶解,浓缩物（检查萜类、内酯、强心甘）,天然产物化学成分的预试验流程图,2-1,生物碱 常用碘化铋钾（Dragend

3、orff试剂），显棕黄色或橘红色沉淀。 黄酮 将乙醇液加镁粉，滴入浓盐酸后震荡在泡沫处呈桃红色，或与1%AlCl3乙醇溶液呈有色荧光。 皂苷、强心苷、甾体 在乙酐溶液中与浓硫酸反映后显各种红紫色，皂苷水溶液震荡时能产生大量泡沫。,定性试验可初步验证有无上述各类物质,氨基酸和肽 与茚三酮反应显蓝紫色。 蛋白质 双缩脲反应（NaOH +CuSO4）显紫红色 有机酸 与溴酚蓝反应呈黄色 酚类 与FeCl3显紫色、蓝色 糖和苷 与斐林试剂作用有砖红色Cu2O沉淀。,二、天然产物化学成分的系统分离,系统分离包括粗分阶段和细分阶段： 粗分阶段主要指大类物质的分离，如皂苷、 蛋白质等，也可指相似极性物质的分

4、离； 细分阶段称作组分分离。,植物原材料粉末,用乙醇溶液浸提数次， 合并浸液，减压浓缩,浸膏,用热水浸提，搅拌悬浮， 用石油醚抽提数次,水层（或混悬物）,石油醚（或苯）抽提液 （亲脂部位）,用氯仿抽提,水层（或混悬物）,氯仿可溶物（弱极性部位）,用EtOAc萃取5次，分层,水层 （或混悬物）,乙酸乙酯可溶物 （中等极性部位）,正丁醇萃取,水层（强极性部位）,正丁醇层（中等偏大极性部位）,Fig 2-2 天然产物化学成分的系统分离流程,此提取法操作程序较繁，且耗费溶剂和时间。 对无资料可循的中草药、菌类代谢产物，往往先采用这个方法确定有效成分，然后根据实践中的体会和有效成分的理化性质，再改进、简

5、化分离方法。,对于水提液，可采用离子交换树脂将它分为碱、酸和中性三部分，如下图23所示。,目的物为已知成分或已知化学结构类型，如从甘草中提取甘草酸、麻黄中提取麻黄素，或从植物中提取某类成分如总生物碱或总酸性成分时，工作程序比较简单。 一般宜先查阅有关资料，搜集比较该种或该类成分的各种提取方案，尤其是工业生产方法，再根据具体条件加以选用。提取天然产物的常用方法： （一）溶剂法 （二）水蒸气蒸馏法 （三）分馏法 （四）沉淀法 （五）盐析法 （六）透析法 （七）升华法,第二节 活性有效成分的提取,原理： 根据天然产物中各种成分的溶解性能，选用对所需成分溶解度大而对其他成分溶解度小的溶剂，将所需成分从

6、药材组织中溶解出来的一种方法。 包括浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取、连续回流提取。 1）浸渍法以水或稀醇为溶剂，在常温或温热（6080）条件下。适于遇热易破坏及含多量淀粉、黏液质、树胶、果胶的植物。 2）渗漉法 以稀乙醇或酸水为溶剂，不断向药材中添加新鲜溶剂，使其渗过药材。适于遇热易破坏及含多量淀粉、黏液质、树胶、果胶的植物。 但费溶剂、费时。 3）煎煮法 以水为溶剂 对具有挥发性及遇热易破坏成分、对含多量淀粉、黏液质成分的药材不宜用。 4）回流提取 以有机溶剂加热回流。对遇热易破坏的成分有影响，费溶剂、操作麻烦。 5）连续回流提取 弥补回流提取的缺点。提取效率高，节省溶剂,但时间较长。,(

7、一)溶剂法,1.采用几种不同极性的溶剂分步提取 选择三四种不同极性的溶剂，由低极性到高极性分步进行提取，使各成分依其在不同极性溶剂中溶解度的差异而得到分离。 一般先采用极性低的、与水不相混溶的有机溶剂，如石油醚、苯、氯仿、乙醚等；这些溶剂的选择性能强，但有些有毒，易燃（氯仿除外），价格昂贵，对浸入植物组织的能力较弱； 再用能与水相溶的有机溶剂，如丙酮、乙醇、甲醇等，最后用水提取。 目前常用的两种系统为A、己烷乙醚甲醇水；B、己烷二氯甲烷甲醇水。在室温下一次提取，这样可使植物中非极性与极性化合物得到初步分离。,(一)溶剂法,2.单一溶剂提取 A水 常用的溶剂中，水为取之不尽、用之不竭的溶剂。水是

8、一种强极性溶剂，天然药物中亲水性的成分，如无机盐、糖类、分子不太大的多糖类、鞣质、氨基酸、蛋白质、有机酸盐、生物碱盐及其苷类等都能被水溶出。 有时为了增加某些成分的溶解度，也常采用酸水或碱水作为提取溶剂。例如多数游离的生物碱是亲脂性化合物，不溶或难溶于水，但与酸结合成盐后，能够离子化，加强了极性，就变成了亲水的物质，不溶或难溶于有机溶剂，所以通常用酸水提取生物碱。 对于有机酸、黄酮、蒽醌、内酯、香豆素以及酚类成分，则常用碱水提取，可使成分易于溶出。,(一)溶剂法,水提取存在的问题也不少，主要有以下几点： 水提取易酶解苷类成分，且易霉坏变质。 某些含果胶、粘液质类成分的天然药物，其水提取液常常很

9、难过滤。 沸水提取时，天然药物中的淀粉可被糊化，而增加过滤的困难。故含淀粉量多的天然药物，不宜磨成细粉后加水煎煮。 天然药物水提取液中含有皂苷及粘液质类成分，在减压浓缩时，还会产生大量泡沫，造成浓缩的困难。通常在实验室中往往加少量的戊醇或辛醇来克服，或可在蒸馏器上装置一个气-液分离防溅球加以克服，工业上则常用薄膜浓缩装置。,B亲水性的有机溶剂 指与水能混溶的有机溶剂，如乙醇（酒精）、甲醇（木精）、丙酮等，以乙醇最常用。 乙醇的溶解性能比较好，对天然药物细胞的穿透能力较强。天然药物中除亲水性成分如蛋白质、粘液质、果胶、淀粉、部分多糖，油脂和蜡质等外，其余成分在乙醇中皆有一定程度的溶解度；一些难溶

10、于水的亲脂性成分在乙醇中的溶解度也较大。 而且乙醇的浓度还可以根据被提取物质的性质而变化，采用不同浓度的乙醇进行提取。用乙醇提取时，乙醇的用量、提取时间皆比用水提取节省，溶解出来的水溶性杂质也少。 乙醇为有机溶剂，虽易燃，但毒性小，价格便宜，来源方便，有一定设备即可回收反复使用，而且乙醇的提取液不易发霉变质。 因此乙醇是实验室和工业生产中应用范围最广的一种溶剂，是历来提取最常用的一种溶剂。甲醇的性质虽和乙醇相似，沸点也比较低（64），但因为有毒性，所以提取时少用，使用时应注意安全。,(一)溶剂法,C亲脂性的有机溶剂 与水不能互溶的有机溶剂，如石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷等。这些溶

11、剂的选择性强，不能或不容易提出亲水性杂质，易提取亲脂性的物质，如油脂、挥发油、蜡、脂溶性色素等强亲脂性的成分。 这类溶剂容易挥发，多易燃（氯仿除外），一般有毒，价格较贵，设备要求也比较高，操作需要有通风设备。 另外这类试剂透入植物组织的能力较弱，往往需要长时间反复提取才能提取完全。 药材中水分的存在，会降低这类溶剂的穿透力，很难浸出其有效成分，影响提取效率，所以对原料的干燥度要求较高。 鉴于以上原因，在大量提取中草药原料时，或工业生产时直接应用这类溶剂有一定的局限性。,(一)溶剂法,D 酸性、碱性有机溶剂 如果有效成分是酸性或碱性化合物，常可加入适当的酸或碱，再用有机溶剂提取。 例如生物碱在植

12、物体中一般与酸结合成盐存在，在生药中加入适量的碱液，拌匀，使生物碱游离出来，再用有机溶剂（如苯、氯仿）提取。同样，有机酸可加酸使其游离，然后用有机溶剂提取。 提取可以在室温下进行，亦可用蒸气浴加热提取，一般来说，冷提杂质较少，而热提效率较高，但杂质较多。 在不了解有效成分的情况下，一般采用冷渗或室温浸渍，提取液在60以下浓缩，如溶剂沸点超过70则采用减压蒸馏浓缩，若有固体或结晶，可滤出，与母液分开后再进一步分离纯化其中的成分。 在提取分离过程中，应该注意，复杂的混合物在各成分之间具有助溶的作用，经提纯后往往难溶或不溶于原来的提取溶剂中。,(一)溶剂法,3.两种或两种以上溶剂 利用植物中所含成分

13、在某种溶剂中溶解度的差异而达到分离的目的。,(一)溶剂法,4.液-液分配萃取 原理：利用混合物中的各成分在两种互不相溶的溶剂中，由于分配系数不同而达到分离的目的。分配系数在一定温度及压力下为一常数，可用下式表示：K=Cu/CL Cu：表示溶质在上相溶剂中的浓度； CL：表示溶质在下相溶剂中的浓度。 萃取时如果各成分在两相溶剂中分配系数相差越大，则分离效率越高； 若所需成分是脂溶性，可用有机溶剂如苯、氯仿或乙醚与水进行液液萃取，可除去水溶性物质糖类、无机盐等； 若所需成分是亲水性物质，其水溶液用弱亲脂性溶剂，如乙酸乙酯、丁醇、戊醇等萃取。有时可在氯仿或二氯甲烷中加少量甲醇或乙醇进行萃取。,(一)

14、溶剂法,5.反应溶剂萃取 通常内酯类化合物不溶于水，其内酯环遇碱水解成为羧酸盐而溶于水，再加酸酸化，可重新形成内酯环，回复原物而不溶于水，从而与其它杂质分开。 从蛔蒿中提取驱蛔有效成分山道年就利用此性质。,(一)溶剂法,适于具有挥发性，能随水蒸气蒸馏而不被破坏的有效成分的提取。 这些化合物与水不相混溶或仅微溶，且在约100时有一定的蒸气压，当水蒸气加热沸腾时，能将该物质一并随水蒸气带出。 例：大蒜素（allicin）的提取 大蒜用酒精浸泡，酒精提取液减压蒸去大部分酒精后，剩余液加水稀释，继续减压蒸馏，这时大蒜素随水一起蒸出，蒸出液用乙醚抽提，醚液浓缩干，即得油状的大蒜素。,（二）水蒸气蒸馏法,

15、水蒸气蒸馏装置,分馏就是多次蒸馏。 利用分馏技术甚至可以将沸点相距12的混合物分离开来。 例：在分离毒芹总碱中的毒芹碱和羟基毒芹碱时，可利用它们的沸点不同进行常压或减压分馏，然后再精制纯化。,（三）分馏法,原理：利用某些植物成分与某些试剂产生沉淀的性质而得到分离或除去“杂质”的方法即为沉淀法。 最常用铅盐法中性乙酸铅或碱式乙酸铅，在水或稀醇溶液中能与许多物质生成难溶性的铅盐或鉻盐沉淀。 脱铅方法通常用硫化氢气体，使分解并转为不溶性硫化铅沉淀而除去。 通入空气或CO2让气泡带出多余的硫化氢气体,（四）沉淀法,脱铅的方法也可使用硫酸、磷酸、硫酸钠等物质，但生成的硫酸铅及磷酸铅在水中有一定的溶解度，

16、所以脱铅不彻底； 由于方法比较简便，故实验室中仍常采用阳离子交换树脂，虽可脱铅，但植物中离子性化合物也同时被交换而损失，并促使离子交换树脂老化，因此不常采用。,表22 几种实验室常用的沉淀剂,油茶饼乙醇提取减压蒸馏浓缩残渣加乙醚脱脂不溶物再溶于乙醇中加乙醚使皂苷析出沉淀物溶于乙醇，加胆固醇沉淀，过滤沉淀干燥后置于索氏抽提器中用苯回流不溶物为皂苷，苯液浓缩后可回收胆固醇。 此皂苷对麦胚芽的生长具有明显的抑制作用。,例如：油茶皂苷的提取,一般来说，所有固体溶质都可以在溶液中加入中性盐而沉淀析出，这一过程叫盐析。 常用的沉淀剂有NaCl、NH4Cl、(NH4)2SO4、Na2SO4、 MgSO4等。

17、 例如，三颗针根粉用稀酸浸泡，稀酸液加NaCl近饱和即析出小檗碱盐酸盐。,（五）盐析法,（六）透析法,透析是利用具有特定大小、均匀孔径的透析膜或超滤膜 的筛分机理，在不加压或加压的条件下，水和小分子物质 选择性通过半透膜，酶、蛋白质等大分子物质则被截留而 达到分离的方法。 常用于纯化皂苷、蛋白质、多肽和多糖等化合物。 透析成功与否与膜孔的大小密切相关，根据欲分离成份 分子的大小选择适当规格的透析膜，常用的有动物膜（如猪 牛的膀胱）、火棉胶膜、蛋白质胶膜和玻璃纸膜等。,市场有透析膜管出售，举例如下： 天花粉蛋白质的分离：天花粉是葫芦科植物栝楼的新鲜根，刨去麦皮，压汁放置过夜后离心除去沉淀，上清液

18、加硫酸铵分级沉淀，饱和度分别为40%、50%及75%，最后所得蛋白质沉淀，加水溶解置于半透膜袋中进行透析，透析液无硫酸根反应为止，将袋内液体冷冻干燥即得。,固体物质受热直接气化，遇冷后又凝固为固体化合物，称为升华。 例如樟木中的樟脑 、茶叶中的咖啡因具有升华特性。,（七）升华法,一、根据物质溶解度差别进行分离 二、根据物质在两相溶剂中的分配比 不同进行分离 三、根据物质的吸附性差别进行分离 四、根据物质分子大小进行分离 五、根据物质解离程度不同进行分离 六、其他分离方法,第三节 天然产物的分离和精制,1. 利用温度不同可引起物质溶解度的改变的性质 以分离物质，如常见的结晶和重结晶。 （1）结晶

19、的条件 过饱和溶液，适合的温度5-10，静置。 （2）结晶溶剂的选择 溶剂能对所需成分的溶解度随温度的不同而有 明显的差别，即热时溶解，冷时析出。对杂质 来说，在该溶剂中应不溶或难溶。 常用的结晶溶剂有CH3OH 、EtOH、Acetone 和EtOAc等。,一、根据物质溶解度差别进行分离,结晶形成过程包括晶核的形成与结晶的生长两部分。 选择适当的溶剂是形成晶核的关键。 加晶种是诱导晶核形成的有效手段。 （4）不易结晶或非晶体化合物的处理 化合物不易结晶，原因一是本身的性质所决定的。二是由于夹杂不纯物质引起的。 若是化合物本身的性质，需要制备其结晶性的衍生物或盐。 常用的有盐酸盐、氢溴酸盐、氢

20、碘酸盐、过氯酸盐和苦味酸盐等。,（3）制备结晶的方法,每种化合物的结晶都有一定的形状、色泽和 熔点，可以作为初步鉴定的依据。 纯化合物结晶的熔点熔距应在 1-2内。 经典方法判断化合物的纯度是比较复结晶前 后结晶的形状和熔点。 结晶的形状很多，常见为针状、柱状、棱柱 状、板状、片状、方晶、粒状、簇状及多边形棱 柱状晶体等。,（5）结晶纯度的判断,2. 在溶液中加入另一种溶剂以改变混合剂的极性，使一部分物质沉淀析出，从而实现分离。 例如： 在药材浓缩水提取液中加入数倍量高浓度乙醇，以沉淀除去糖类、蛋白质等水溶性杂质（水提醇沉法）； 或在浓缩乙醇提取液中加入数倍量水稀释，放置使沉淀而除去树脂、叶绿

21、素等水不溶性杂质（醇提水沉法）。,3. 酸性、碱性或两性有机化合物，可加入酸、碱以调节溶液的pH值，改变分子的存在状态（游离型或解离型），从而改变溶解度而实现分离。 例如： 一些生物碱类用酸水从药材中提出后，加碱调至碱性即可从水中沉淀析出（酸提碱沉法）。,4. 酸性或碱性化合物可以通过加入某种沉淀试剂使之生成不溶于水的盐类沉淀析出。 例如： 酸性化合物可生成钙盐、钡盐等，碱性化合物如生物碱等可生成苦味酸盐、苦酮酸盐等有机酸盐或磷钼酸盐、磷钨酸盐等。,一、根据物质溶解度差别进行分离 二、根据物质在两相溶剂中的分配比 不同进行分离 三、根据物质的吸附性差别进行分离 四、根据物质分子大小进行分离 五

22、、根据物质解离程度不同进行分离 六、其他分离方法,第三节 天然产物的分离和精制,1. 液-液萃取法 2. 纸层析 3. 液-液分配柱色谱 4. 分配薄层色谱法,二、根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离,（1）分配系数K值 两种不能互溶的溶剂（如石油醚与水）置于分液漏斗中进行充分振摇，放置后即可分成两相。此时其中含有的溶质在两相溶剂中的分配比在一定温度及压力下为一常数。 可用下式表示： K=Cu/CL Cu：表示溶质在上相溶剂中的浓度； CL：表示溶质在下相溶剂中的浓度。,1.液-液萃取,例如：现在假定有A、B两种溶质用氯仿和水进行分配，A、B均为1g，KA =10，KB=0.1，两相溶剂体

23、积比V氯仿/V水=1，q请问用分液漏斗需做几次分配可基本上实现分离？ 解：第一次振荡分配平衡后， KA C水/ C氯仿10，由于V氯仿 V水，CV=m 所以mA水/ mA氯仿10，即mA水10 mA氯仿 一次振荡分配平衡后，溶质A90%以上将分配在上相溶剂（水）中，不到10%则分配到下相溶剂（氯仿）中。 同理，由于KB=0.1，所以振荡分配平衡后，溶质B的分配将与A相反。不到10%留在水中，90%以上分配在氯仿中 。 在上述条件下，A、B两种溶质在氯仿和水中仅作一次分配就可实现90%以上程度的分离。,用分离因子值来表示分离的难易。 分离因子定义： A、B两种溶质在同一溶剂系统中分配系数 的比值

24、。即：=KA/KB（注：KAKB） 100，作一次简单萃取就可实现基本分离； 10010，则需萃取10-12次； 2时，需做100次以上萃取； 1时，KAKB，作任意次分配也无法实 现分离。,（2）分离难易与分离因子,对酸性、碱性及两性有机化合物来说，pH值变化可以改变它们的存在状态（游离态或解离型），从而影响在溶剂系统中的分配比。 以酸性物质为例，其在水中的解离平衡及解离常数K，可用下式表示： HA + H2OA- + H3O+ 当pH值3时，酸性物质多呈非解离状态（HA）、碱性物质则呈解离状态（BH+）存在； 当pH值12，则酸性物质呈解离状态（A-）、碱性物质则呈非解离状态（B）存在。,

25、（3）分配比与pH值,图2-5 利用pH梯度萃取分离物质的模式,逆流分溶法（counter current distribution，CCD） 是一种多次、连续的液-液萃取分离过程。 原理相当于多个分液漏斗相连接。 现一般采用逆流分溶仪，该仪器为由上百个萃取单 元组成的全自动连续液-液萃取装置。每个单元相当于一个分 液漏斗。 操作程序主要是振摇萃取静置分层两相分开转移再萃取。,（4）逆流分溶法,纸层析又叫纸色谱法，系以纸为载体，以纸上所含水分或其他物质为固定相，用展开剂进行展开的分配色谱。 供试品经展开后，可用比移值(Rf)表示其各组成成分的位置。 比移值原点中心至斑点中心的距离原点中心至展开

26、剂前沿的距离,2. 纸层析,纸色谱,1）展开室 通常为圆形或长方形玻璃缸，缸上具有磨口玻璃盖，应能密闭。 2）点样器 常用具支架的微量注射器或定量毛细管, 应能使点样位置正确、集中。 3）滤纸 质地均匀平整，具有一定机械强度，不含影响展开效果的杂质；也不应与所用显色剂起作用。,（1）仪器与材料,1）上行法 2）下行法 （3）特殊纸色谱 1）反相纸层析 2）高温纸层析 3）盐析纸层析,（2）操作方法,定义： 将两相溶剂中的一相涂覆在硅胶等多孔载体上，作为固定相，填充在色谱管中，然后加入与固定相不相混融的另一相溶剂（流动相）冲洗色谱柱。这样，物质同样可在两相溶剂相对作逆流移动，在移动过程中不断进行

27、动态分配而得以分离。,3.液-液分配柱色谱,常用的载体主要有硅胶、硅藻土及纤维素粉等。 分离水溶性或极性较大的成分，固定相多采用强极性溶剂，如水、缓冲液等，流动相则用氯仿、乙酸乙酯等有机溶剂，称之为正相层析； 分离脂溶性化合物，如高级脂肪酸等时，则两相可以颠倒，固定相可用石蜡油，而流动相则用水或甲醇等强极性溶剂，称之为反相层析。,（1）正相层析与反相层析,加压液相柱层析用的载体多为颗粒直径较小，机械强度及比表面积均大的球形硅胶微粒。 按加压强弱可以分为： 快速色谱（flash chromatography，约2.02105Pa） 低压液相色谱（LPLC，5.05105 Pa） 中压液相色谱（M

28、PLC，5.05105-20.2105Pa） 高压液相色谱（HPLC，20.2105Pa）,（2）加压液相柱层析,减压液相柱层析是利用真空为动力来加速流动相的一种色谱分离方法。 减压液相色谱法具有设备简单、分离时间短、分离容量大等特点。,（3）减压液相柱层析,常用的支持剂有硅藻土、纤维素、滑石粉等，最常用的固定相是甲酰胺。 原理：多次分配的过程，分配系数(溶解度)不等实现分离。 分类：正相色谱，反相色谱 正相色谱：水为固定相(硅胶载体)，有机溶剂为流动相，极性强的组分K（分配系数）大，Rf值小； 反相色谱：烷基化学键合相为固定相，水-有机溶剂为流动相，极性强的组分K小， Rf值大。,4. 分配

29、薄层色谱法,一、根据物质溶解度差别进行分离 二、根据物质在两相溶剂中的分配比 不同进行分离 三、根据物质的吸附性差别进行分离 四、根据物质分子大小进行分离 五、根据物质解离程度不同进行分离 六、其他分离方法,第三节 天然产物的分离和精制,物理吸附、化学吸附及半化学吸附 物理吸附也叫表面吸附，因构成溶液的分子（含溶质及溶剂）与吸附剂表面分子的分子间力相互作用所引起的 。 化学吸附如黄酮等酚酸性物质被碱性氧化铝的吸附，或生物碱被酸性硅胶的吸附等，具有选择性，吸附十分牢固，有时甚至不可逆。 半化学吸附，如聚酰胺对黄酮类、醌类等化合物之间氢键吸附，力量较弱，介于物理吸附与化学吸附之间。,三、根据物质的

30、吸附性差别进行分离,固液吸附时，吸附剂、溶质、溶剂三者统称为吸附过 程中的三要素。 极性吸附剂硅胶、氧化铝。具有特点： 1）对极性物质具有强的亲和能力，故极性强的溶质将 被优先吸附。 2）溶剂极性越弱，则吸附剂对溶质将表现出越强的吸 附能力。溶剂极性增强，则吸附剂对溶质的吸附能力即随 之减弱。 3）溶质即使被硅胶、氧化铝吸附，但一旦加入极性较 强的溶剂时又可被后者置换洗脱下来。,1. 物理吸附基本规律相似者易于吸附,非极性吸附剂活性炭。 对非极性物质具有较强的亲和能力，在水中对溶质表现出强的吸附能力。 溶剂极性降低，则活性炭对溶质的吸附能力即随之减弱。 从活性炭上洗脱被吸附物质时，洗脱溶剂的洗

31、脱能力将随溶剂极性的降低而增强。,极性强弱是支配物理吸附过程的主要因素。 极性判断： 1）化合物的极性大小依化合物的官能团的极性大小而定。 R-COOH Ar-OH H2O R-OH R-NH2，R-NH-R， R-N-RR R-CO-N- RR R-CHO R-CO-RR-CO-OR R-O-RR-XR-H,2. 极性及其强弱判断,2）溶剂的极性可以根据介电常数的大小来判断,表23 常见溶剂的介电常数,简单吸附，常见如在结晶及重结晶过程中加入活性炭进行的脱色、脱臭等操作，在物质精制过程中应用很广。 注意，有时拟除去的色素不一定是亲脂性的，故活性炭脱色不一定总能收到良好的效果。 一般需根据预试

32、结果先判断色素的类型，再决定选用什么吸附剂处理为宜。,3. 简单吸附法,吸附色谱法定义： 是指用吸附剂作固定相，利用被分析组分对吸附剂表面吸附能力的差异和在流动相中溶解度的差异来进行分离分析的方法。 按其操作方式可以分为柱层析色谱和薄层色谱。 吸附色谱法常用吸附剂有硅胶、氧化铝、聚酰胺和活性炭等。,4. 吸附色谱法用于物质的分离,色谱柱为内径均匀、下端缩口的硬质玻璃管，下端用棉花或玻璃纤维塞住，管内装入吸附剂。,（1）吸附柱色谱,操作步骤： 吸附剂的填装 试品的加入 洗脱,干法将吸附剂一次加入色谱柱，振动管壁使其均匀下沉，然后沿管壁缓缓加入洗脱剂；或在色谱柱下端出口处连接活塞，加入适量的洗脱剂

33、，旋开活塞使洗脱剂缓缓滴出，然后自管顶缓缓加入吸附剂，使其均匀地润湿下沉，在管内形成松紧适度的吸附层。 湿法将吸附剂与洗脱剂混合，搅拌除去空气泡，徐徐倾入色谱柱中，然后加入洗脱剂将附着管壁的吸附剂洗下，使色谱柱面平整。, 吸附剂的填装,将供试品溶于开始洗脱时使用的洗脱剂中，再沿管壁缓缓加入，注意勿使吸附剂翻起。 或将供试品溶于适当的溶剂中，与少量吸附剂混匀，再使溶剂挥发去尽使呈松散状，加在已制备好的色谱柱上面。, 试品的加入, 洗脱 通常按洗脱剂洗脱能力大小递增变换洗脱剂的品种和比例，分别分部收集流出液，至流出液中所含成分显著减少或不再含有时，再改变洗脱剂的品种和比例。操作过程中应保持有充分的

34、洗脱剂留在吸附层的上面。,系将适宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上，成一均匀薄层。 待点样、展开后，与适宜的对照物按同法所得的色谱图作对比，用以进行药品的鉴别、杂质检查或含量测定的方法。,（2）吸附薄层色谱法, 玻板。要求光滑、平整，洗净后不附水珠，晾干。 固定相或载体。 最常用的有硅胶G、硅胶GF254 、硅胶H、 硅胶HF254； 薄层涂布，一般可分无粘合剂和含粘合剂两种。常见粘合剂： 1015煅石膏， 0.50.7羧甲基纤维素钠水溶液。 涂布器。 点样器 。 展开室。,1）仪器与材料, 薄层板制备 将1份固定相和3份水在研钵中向一方向研磨混合，去除表面的气泡后，倒入涂布器中，在玻板上

35、平稳地移动涂布器进行涂布（厚度为0.20.3mm），取下涂好薄层的玻板，置水平台上于室温下晾干，后在110烘30分钟，即置有干燥剂的干燥箱中备用。 点样 用点样器点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线距底边1.0cm，点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。,2）操作方法, 展开 将点好样品的薄层板放入展开室的展开剂中，浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.51.0cm，密封室盖，待展开至规定距离，取出薄层板，晾干，按规定检测。 显色和Rf值 Rf=展开后原点与斑点的距离/原点与溶剂前沿间距离。 也可以通过相对比移值对所得物质进行定性的分析， Rr=Rf(a)/ Rf(s)=被测组分移动的距离/参

36、考物质移动的距离 a-被分离组分，s-参考物质。 Rr值的重复性和可比性都优于Rf。,2）操作方法,点样,薄层板在不同的层析缸中展开的方式,黄绿色,棕褐色,红色,浅蓝色,亮绿色,紫罗兰色,褐色,表24 常见化合物的薄层色谱显色剂, 吸附剂的用量。一般为样品量的30-60倍，样品极性小，难以分离者，吸附剂用量可适当提高至样品量的100-200倍。 尽可能选择极性小的溶剂装柱和溶解样品，以利于样品在吸附柱上形成狭窄的原始谱带。 洗脱所用溶剂的极性宜逐步增加，跳跃不能太大。 实验室常用的混合溶剂如下所示： 吸附柱色谱常用的混合溶剂（极性递增）己烷-苯，苯-乙醚，石油醚-乙酸乙酯，氯仿-乙醚，氯仿-乙

37、酸乙酯，氯仿-甲醇，丙酮-水，甲醇-水,（3）注意的问题,为避免发生化学吸附，酸性物质宜用硅胶作吸附剂、碱性物质则宜用氧化铝作吸附剂进行分离。 通常在分离酸性（或碱性）物质时，洗脱溶剂中分别加入适量醋酸（氨、吡啶、二乙胺），可收到防止脱尾，促进分离的效果。 吸附柱色谱也可用加压方式进行。 溶剂系统也可通过TLC进行筛选，一般TLC展开时使组分Rf值达到0.2-0.3的溶剂系统可选用为柱色谱分离该相应组分的最佳溶剂系统。,（3）注意的问题,5. 聚酰胺吸附色谱法,聚酰胺吸附属于氢键吸附，特别适合分离酚类、醌类、黄酮类化合物。 一般认为通过分子中的酰胺羰基CO与酚类、黄酮类化合物的酚羟基Ar-OH

38、，或酰胺键上的游离氨基NH2与醌类、脂肪羧酸上的羰基形成氢键缔合而产生吸附。 至于吸附强弱则取决于各种化合物与之形成氢键缔合的能力。,1. 形成氢键的基团数目越多，则吸附能力越强。,聚酰胺的吸附能力在水中规律：,2. 成键位置对吸附力也有影响。易形成分子内氢键者， 其在聚酰胺上的吸附相应减弱。,3.分子中芳香化程度高者，则吸附性增强；反之，则减弱。,一般情况下，各种溶剂在聚酰胺柱上的洗脱能力由弱至强，可大致排列成下列顺序： 水甲醇丙酮氢氧化钠水溶液甲酰胺二甲基甲酰胺尿素水溶液。,聚酰胺对一般酚类、黄酮类化合物的吸附是 可逆的，适合于该类化合物的制备分离； 对生物碱、萜类、甾体、糖类等其他极性与

39、非极性化合物的分离也有着广泛的用途； 对鞣质的吸附特强，近乎不可逆，故用于植物粗提物的脱鞣质处理特别适宜。,大孔吸附树脂是一种不含交换基团的、具有大孔结构的高分子吸附剂，也是一中亲脂性物质。 原理： 大孔吸附树脂为吸附和筛选原理相结合的分离材料。它的吸附性是由于范德华引力或生成氢键的结果。筛选原理是由于其本身多孔性结构所决定。由于吸附和筛选原理，有机化合物根据吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附脂上经一定的溶剂洗脱而分开。,6.大孔吸附树脂色谱,6.大孔吸附树脂色谱,大孔吸附树脂多为白色的球状颗粒，粒度多为 2060目。 分为非极性和极性两大类。 目前常用的为苯乙烯型和丙烯腈型，在树脂合 成

40、时根据需要引入极性基团则成为极性树脂从而增 强吸附能力。 理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂。 对有机物的选择性较好，不受无机盐类及强离子 低分子化合物存在的影响。,6.大孔吸附树脂色谱,中药分离提取操作的基本程序： 中药提取液通过大孔树脂吸附上有效成分的树脂洗脱洗脱液回收溶液药液干燥半成品。 洗脱液： 可使用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。 应用： 现已被广泛应用于苷与糖类的分离，生物碱的精制，多糖、黄酮、三萜类化合物的分离等。,7. 高效液相色谱法（HPLC）,HPLC是在经典液相色谱基础上引入气相色谱的 塔板理论，并采用了高压输液泵、高效固定相和 高灵敏度的检测器，具有分析速度快、分离效

41、率 高和操作自动化特点的一种色谱技术。,常用的HPLC检测器： 紫外-可见分光检测器、 示差折光检测器,一、根据物质溶解度差别进行分离 二、根据物质在两相溶剂中的分配比 不同进行分离 三、根据物质的吸附性差别进行分离 四、根据物质分子大小进行分离 五、根据物质解离程度不同进行分离 六、其他分离方法,第三节 天然产物的分离和精制,1. 凝胶过滤法 2. 透析法 3. 超滤,四、根据物质分子大小进行分离,1）原理： 凝胶过滤法也叫凝胶渗透色谱法 (Gel Permeation Chromatography，简称GPC法)，分子筛过滤、排阻色谱。 其原理主要是利用具有网状结构的凝胶分子筛的作用，根据

42、被分离物分子大小不同而分离。待分离系统中小分子物质直径比凝胶孔径小，可渗入凝胶微孔中，产生阻滞作用大、流程长、移动速度慢，最后流出，而大分子由于阻滞作用小，流程短，移动速度快，先流出。,1. 凝胶过滤法,凝胶色谱分离原理图, 交联葡聚糖凝胶(Sephadex) 以葡聚糖凝胶为原料，交联剂为环氧氯丙烷，在碱性条件下制成三维空间网状结构。 目前市售SephadexG10至G200共有8种。 G表示凝胶保水值，单位为ml/g干胶，G后面的数字代表凝胶吸水量的10倍。 G-25表示每克干胶膨胀时吸水2.5ml，G-200表示每克干胶膨胀时吸水20ml。,2）该法应用的凝胶：,Sephadex G-25

43、中的OH经OCH2CH2CH2OH 取代后得到的产物。 与Sephadex G比较，Sephadex LH-20分子中 -OH总数没有改变，但碳原子所占比例却相对增加了。 因此与Sephadex G 仅有亲水性不同，它不仅可在水中应用，也可以在极性有机溶剂或它们与水组成的混合溶剂中膨润使用。, 羟丙基葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20）,琼脂糖是从天然琼脂中分离制备的链状多糖，结构单元为交替排列的D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖。琼脂糖链间以氢键相互连接形成琼脂糖束，经凝聚处理后构成琼脂糖凝胶。 琼脂糖的商品名因生产厂家不同而异。 瑞典的商品名为Sepharose；美国的为Bio-G

44、el A；英国的为Segavac；丹麦的为Gelarose 。, 交联琼脂糖凝胶,除Segavac外，都是悬浮于10-3mol/l EDTA和0.02%NaN3（叠氮化钠）溶液中以湿态形式出售。 Sepharose有三种型号：Sepharose 2B、4B和6B。 数字表示凝胶中干胶的百分含量。从2B到6B，琼脂糖浓度逐渐增加，筛孔逐渐减小，机械强度依次增大。, 交联琼脂糖凝胶,聚丙烯酰胺凝胶是全合成的凝胶。 商品名Bio-Gel P-。 P-后的数字乘以1 000，表示该种凝胶可应用于分离蛋白质的最高分子质量。 P后面的数字越大，越适合于大分子的分离。, 聚丙烯酰胺凝胶,透析法是利用小分子物

45、质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过半透膜的性质，达到分离的方法。 例如分离和纯化皂甙、蛋白质、多肽、多糖等物质时，可用透析法以除去无机盐、单糖、双糖等杂质。 透析膜有动物性膜、火棉胶膜、羊皮纸膜（硫酸纸膜）、蛋白质胶膜、玻璃纸膜等。,2. 透析法,透析袋,1) 原理 超滤是一种以压力为驱动力，利用超滤膜的筛分作用，根据相对分子质量的不同来进行分离的膜技术。 超滤膜的孔径通常在1300nm之间，选用不同孔径的超滤膜，可以将相对分子质量在几百到几十万之间的物质进行分离。 待分离组分的大小一般要相差10倍以上。,3. 超滤法,2) 超滤膜的选择 截留分子量的选择 膜的孔径或截留分子量的选择

46、虽然主要是根据被分离物的相对分子质量。 超滤膜的选择 膜表面是液体和膜相互作用的界面，溶质和膜之间有静电相互作用或电荷转移反应，膜表面的极性、溶液的pH值等均会影响膜的分离效率。 最好采用抗污性较好的膜材料，如聚丙烯腈、磺化聚砜膜等。,3. 超滤法,3） 超滤法的特点： 选择性高，分离效率高。 减少工序，缩短生产周期（不需加热浓缩），节 约原料，降低成本。 物质不发生相变，常温操作， 有效成分不被破 坏，能保持原配方的成分。 去杂质效果好。 除菌效果好。 超滤后可得到无菌澄清的药液，代替加热灭菌。,3. 超滤法,超滤柱提纯大分子物质示意图,压力：6.91046.9105Pa,一、根据物质溶解度

47、差别进行分离 二、根据物质在两相溶剂中的分配比 不同进行分离 三、根据物质的吸附性差别进行分离 四、根据物质分子大小进行分离 五、根据物质解离程度不同进行分离 六、其他分离方法,第三节 天然产物的分离和精制,离子交换法 1. 原理： 以离子交换剂作为固定相，以水或含水溶剂作为流动相。当流动相流过交换柱时，溶液中的中性分子及与离子交换剂不能发生交换的离子将通过柱子从柱底流出，而可发生交换的离子则与交换基团进行离子交换并吸附到柱上，然后改变条件，用适当溶剂将其从柱上洗脱下来，即可实现物质分离。,五、根据物质解离程度不同进行分离,离子交换法,2. 结构与性质 根据离子交换剂所含功能团的酸碱性，可分为

48、阳离子交换剂和阴离子交换剂两大类；根据交换剂的基质性质，可分为离子交换树脂、离子交换纤维素、离子交换凝胶三种。 离子交换剂含有解离性离子交换基团（功能基团）的高分子物质，由两部分组成：一部分是大分子聚合物基质主体结构，另一部分是具有荷电活性的功能基团。,离子交换树脂中的主体结构树脂是人工合成的疏水性物质，如聚苯乙烯、聚苯酚磺酸、聚丙烯酸等。 1）类型： A阳离子交换树脂这类交换树脂基质上共价结合的是带负电荷的活性基团，即反离子为阳离子，能与溶液中带正电荷的物质进行交换。根据其活性基团解离度的不同，可进一步分成强酸型、弱酸型和中等酸型三类。 强酸型：R-SO3H 中等酸型：R-COOH、R-PO

49、3H2 弱酸型：R-OH、R-SH,（1）离子交换树脂,B、阴离子交换树脂这类交换树脂基质上共价结合的是带正电荷的活性基团，即反离子为阴离子，能与溶液中带负电荷的物质进行交换。 强碱型：含有季胺基团，通式为R-NRRROH 中等碱型：主体结构上既结合强碱性基团又结合弱碱性基团 弱碱型：含有伯胺、仲胺或叔胺基团，通式R-NH3OH、R-NH2ROH、R-NHRROH,2）性质 A颜色与形状黑色、黄色和乳白色等。外形大部分呈珠状，大小以目表示。 B交换容量离子交换树脂与溶液中的离子或离子化合物进行交换的能力，它取决于单位质量（或体积）的树脂中活性基团的数目，单位为mmol/g（ml）树脂。 3）应

50、用 A用于不同电荷离子的分离。 B用于相同电荷离子的分离。,离子交换纤维素是由纤维素作主体结构，纤维素上的OH基团被功能团取代而形成的，属于亲水型离子交换剂。 可分为阳离子型和阴离子型。 离子交换纤维素层析的原理和离子交换树脂相似，在植物成分分析方面的区别在于：前者适用于蛋白质、酶等活性大分子；后者适用于aa、肽、核苷酸、生物碱、甾醇、萜类、黄酮等中小分子，以及大分子溶液中表面活性剂、尿素及两性电解质的去除。,（2）离子交换纤维素,离子交换凝胶与离子交换纤维素相同，属于亲水型离子交换剂。 离子交换凝胶兼有分子筛和离子交换两种功能，总交换量比离子交换纤维素大，因此，在某些情况下，分离能力超过了由

51、单一树脂或纤维素构成的离子交换剂。 不足之处：当洗脱溶液的pH值和离子强度改变时，大部分离子交换凝胶的基质体积会发生较大的变化，造成柱体积压紧、流速降低。,（3）离子交换凝胶,一、根据物质溶解度差别进行分离 二、根据物质在两相溶剂中的分配比 不同进行分离 三、根据物质的吸附性差别进行分离 四、根据物质分子大小进行分离 五、根据物质解离程度不同进行分离 六、其他分离方法,第三节 天然产物的分离和精制,主要用于生物大分子与固定相之间的特异亲合力进行选择性分离及纯化的方法。 分离原理：于载体表面先键合具有一般反应性能的环氧或联氨（称为间隔臂），然后再连接上配基，如酶、抗原或激素。当含有复杂混合试样的

52、流动相流经这种经固定化的配基时，其中具有亲合力特性的生物大分子与配基相互作用而被保留，无此作用的则被洗出；随后，改变流动相pH值或组成，再将被保留的大分子组分以纯品的形式洗脱出来。,1.亲合色谱,亲和色谱示意图,超临界流体萃取法是利用超临界状态下的流体为萃取剂，从液体或固体中萃取中药材中的有效成分并进行分离的方法。 CO2因其本身无毒、无腐蚀、临界条件适中（7.488Mpa，304.15K）的特点，成为超临界流体萃取法最为常用的超临界流体（SF）。 现已成功利用超临界流体提取法提取到了青蒿素，延胡索乙素，薯蓣皂苷、玫瑰精油、卵磷脂等。,2. 超临界流体萃取法,从天然物中分离到化合物单体后，需进

53、行结构鉴定，方法有波谱法，化学法，文献调研等。 1) 纯化和干燥化合物的样品 2) 通过文献调研，理化常数和化学定性分析等初步判断结构类型 3) 由波谱法等确定分子式，分子量，不饱和度；进一步推出结构官能团推出结构片断或骨架推出平面结构确定其构型，构象。,第四节 天然产物化学成分的结构鉴定,1. 检查样品有无均匀一致的晶形，有无明确尖锐的熔点等； 2. 薄层层析TLC（荧光、显色剂）。一般，只有当样品在三种展开系统中均呈现单一斑点时方可确认其为单一化合物，个别情况下，甚至须采用正、反相层析两种方式加以确认。 3. 气相色谱GC和HPLC是一种很好的检测方法，省时、灵敏度高。,一、化合物的纯度测

54、定,1. 已知化合物鉴定的一般程序 1）测定样品的熔点，与已知品的文献值对照，比较 是否一致或相近 2）测定样品与标准品的混熔点，所测熔点值不下降 3）将样品与标准品共薄层色谱或纸色谱，比较其Rf值是否一致 4）测定样品的红外光谱图，与标准品的红外光谱或标准谱图进行比较，是否完全一致。,二、结构研究的主要程序,2. 未知化合物结构研究 1）方法 注意样品在提取、分离过程中的行为。 测定有关理化性质，如不同pH值、不同溶剂中的溶解度及层析行为、灼烧实验、化学定性反应等。 结合文献调研。,二、结构研究的主要程序,2. 未知化合物结构研究 2）程序： 进行检识反应，初步推断化合物的类型 化合物分子式

55、的测定a、元素分析结合分子量测定 b、同位素峰法c、高分辨质谱 计算不饱和度 r+db，推测可能存在的基团 测定有关光谱，如IR，UV，1H-NMR，13C-NMR来确定其结构 结构验证： a. 根据初步推断的结果与已知化合物进行比对； b. 测定NOE谱或二维核磁共振谱； c.进行X-ray d. 人工合成。,二、结构研究的主要程序,1. 确定分子式、计算不饱和度 1）元素定量分析 + 分子量测定 一般在进行元素定量分析前应先进行元素定性分析，找出分子中存在哪几种原子。进行元素定量分析，找出各种原子的相对数目，即决定经验式（实验式）。 测定分子量，确定各种原子的确实数目，给出分子式。,三、

56、结构研究中采用的主要方法,例如：从刺果甘草根中分得的某白色针晶，该物质只含有C、H、O三种元素，元素定量分析得到以下结果C：79.35%，H：10.21%，EI-MS测定其分子离子峰（m/z）为456，试确定该化合物的分子式。 解： （1）从100中扣除C 、H后得O=10.44%； （2）C：H：O=79.35%/12.01：10.21%/1.008：10.44%/16.00 =10.16：15.58：1 按倍比定律，原子间的化合一定是整数的，所以最终确定为（C10H16O）n； （3）因为EI-MS测定其分子离子峰（m/z）为456， C10H16O 的分子量为152，所以n=456/15

57、2=3； （4）该化合物最终确定为C30H48O3。,已知组成有机化合物的主要元素（F、P、I除外）均由相对峰度比一定的同位素所组成，且重元素一般比轻元素重1-2个质量单位。 故由重元素组成的分子也将较轻元素组成的正常分子重1-2个质量单位。所以，在大多数有机化合物的MS图上，除分子离子峰M+外，常能看到M+1，M+2的同位素峰。 对一定的化合物来说，其M、 M+1及M+2峰的相对强度始终为一定值（含Cl、Br除外）。,2）同位素峰度比法,高分辨质谱（HR-MS）可将物质的质量精确测定到小数点后第3位。 例如： C8H12N4 、C10H12N2O、C10H12O2、C10H16N2四种化合物

58、，它们的相对分子质量虽都是164，但精确质量并不相同，在HR-MS上可以很容易地进行分别。 C8H12N4 164.1063 C10H12N2O 164.0950 C10H12O2 164.0837 C10H16N2 164.1315,3）高分辨质谱（HR-MS）法,r+db=IV- I/2 + III/2 + 1 I 为一价原子（如H、D、X）的数目； III 为三价原子（如N、P）的数目； IV为四价原子（如C、Si）的数目。 O、S等二价原子与不饱和度计算无关，故不予考虑。,4）计算不饱和度,200400nm为紫外谱区，400700nm为可见谱区 。 （1）UV中常用的光谱术语： max和min表示样品分子的最大和最小吸收波长， max摩尔吸收系数； 发色团：指能吸收光子能量并产生跃迁的不饱和共价键基团，这些基团一般带有电子，