第五章固相析出分离法.ppt

1、5.固相析出分析法、固相析出分析法、盐分析法、有机溶剂沉淀法、其他沉淀法、结晶、等电点沉淀法、成盐沉淀法、亲和沉淀法、高聚物沉淀法、活化剂沉淀法、介绍一般析出物是晶体时称为结晶法，析出物是无定形固体沉淀法应用固相析出分离法，可以控制析出条件，防止大部分杂技被析出或少析出。其特点是设备的简单性、经济性、浓缩倍数高。5.1盐析法，将蛋白质在高离子强度的溶液中溶解减少，沉淀发生的现象定义为盐析。原则1。高浓度盐离子减少蛋白质表面双层厚度，削弱静电排斥作用2。中性盐比蛋白质亲水性强，会使蛋白质和水分子发生争吵。Cohn经验方程，lgS=Ks I，S:蛋白质的溶解度，g/l i3360离子强度Ks :常

2、数，截留与盐的种类无关，与温度和pH蛋白的种类有关，以食(51)为基准，盐析方法分为两类茄子。1，在一定PH和温度下改变离子强度(盐浓度)，称为盐析(Ks盐析法)。2.在离子强度下，只改变PH和温度来进行盐析，这称为B盐析法。5 . 1 . 2 . 2影响盐析的因素，5.1.2.1无机盐的种类负离子对盐析效果的影响是柠檬酸根锡酸根SO4 2-F-io 3 H2 po 4-CH 3C OO-CL-CL O3-BR，阳离子顺序如下：Th4 Al3 H Ba2 Sr 2 Ca2 Ca2 Ca2这是Hofmeister序列，也称为减感离子序列。一般来说，半径较小的高价离子的盐析作用比较强，负离子的阳离

3、子盐析作用，尤其是高价负离子。无机盐选择主义问题，1，盐析作用强。一般来说，多价负离子的盐析作用很强，有时多价阳离子会降低盐析作用。2.盐析用盐要有足够的溶解度，溶解度要尽量减少温度的影响。这样容易得到高浓度盐溶液，有利于操作。特别是在低温度下运行，不会析出盐结晶，影响盐析效果。3.盐析用盐在生物学上是惰性的，不会影响蛋白质等生物分子的活性，因此最好不要引入妨碍分离溴测定的杂质。4、丰富的来源、经济。5.1.2.2溶质(蛋白质等)种类的影响，由于蛋白质种类的不同，Cohn经验表达式中常数Ks和B不同，蛋白质盐析沉淀所需的无机盐量也不同。图53显示了几种蛋白质在(NH4 )2 SO4溶液中的溶解

4、度。5.1.2.3蛋白质浓度的影响，浓度不同，蛋白质溶液产生沉淀所需的临界盐浓度不同。蛋白质浓度大，中性盐的极限沉淀浓度低，共沉淀作用强，分辨率低，但盐量少，蛋白质溶解损失小。相反，如果蛋白质浓度低，中性盐的极限沉淀浓度高，共沉淀作用小，分辨率高，但盐量大，蛋白质回收率低。5.1.2.4温度的影响，在高离子强度溶液中提高温度有助于蛋白质脱水，溶解度下降。在低离子强度溶液或纯水中，蛋白质的溶解度在一定温度范围内通常随着温度的升高而增加。5.1.2.5PH的影响，在接近蛋白质等电点的溶液中盐析有助于蛋白质的沉淀。要注意，蛋白质的等电点可能在高盐溶液中偏移。，5.1.3盐析操作，1 .盐析用盐的浓度

5、大部分情况下用硫酸盐析，硫酸加人的方式有两种。一种是直接添加固体粉末，工业生产经常使用这种方式，添加人的速度太快，渡边杏，要分配人，使人完全溶解，防止其完全溶解，另一种是加氧硫酸根据饱和溶液，在实际和小规模生产中，或者(NH4)2SO4浓度不太高的情况下，通过这种方式，可以防止溶液局部过度浓缩，但如果杨怡太多，可以防止材料液稀释。5.1.3.2盐析方法及注意事项，(1)分级盐析分类盐析方法是最适用的一般操作方法。例如，通过持续增加盐浓度的方法，血浆混合物中可以分别制造3-5茄子主要成分蛋白。生产上有时以低盐浓度去除一部分杂蛋白，然后提高饱和沉淀目的物。此外，分级盐析也是了解高山者或其提取物的溶

6、解性和盐析行为的有效手段。利用盐析曲线指导生产时要注意两个茄子点。实验用提取物的浓度应与生产时一致，其他条件也应相同。在高盐浓度下，一些生物活性物质的活力受到抑制，实验时要排除类似的干扰因素。(2)重复盐析法在实际工作中，为了避免蛋白质浓度太低、体积太大、回收率低的情况，盐析可以采用稍高的蛋白质浓度。此时由于蛋白质浓度高而产生的共沉淀作用，分辨率低的缺点可以用重复盐析方法克服。如果在血清一球蛋白的制备中进行多次，则30%-33%的硫酸根据饱和度的重复盐析获得高纯度。(3)反萃取法在实际工作中消除共沉淀的干扰，首先在一定的盐浓度下与一定量的杂蛋白一起沉淀。然后用低浓度盐溶液平衡沉淀物，溶解其中的

7、杂蛋白，实现纯化，现在以大肠杆菌RNA聚合酶的制备为例(图5，11)。(4)盐析注意事项首先要防止盐析过程中出现不平衡。也就是说，通常被称为“防止局部过浓”。固体盐投人法，首先要将盐粒磨细，不断搅拌，慢慢将人放入溶液中，溶解时不要在容器底部留下未融化的固体盐。这样可以避免因局部过浓而共沉淀和部分蛋白质的变性。(约翰肯尼迪，Northern Exposure(美国电视电视剧)，用饱和盐溶液盐析的时候也要慢慢地加入人，继续搅拌。第二，由于盐析效果受温度的影响很大，为了避免在低温下蛋白质溶解度提高的损失，在室温下进行了很多(10-25)盐分析，少数不稳定、容易活动的物质在0-10盐析中。盐析收入沉着

8、通常要经过老化期才能分离。使用的分离方法必须考虑介质的相对密度和粘度。盐浓度高的时候相对密度高，粘度低，因此有利于过滤法。盐浓度相对较小时，介质相对密度低，粘度大，离心法比较。5.2有机溶剂沉积法定义了水溶液中添加了一定数量亲水性的有机溶剂，降低和沉淀溶质溶解度的分离纯化方法称为有机溶剂沉淀法。原理亲水有机溶剂添加溶液后，降低介质的介电常数，增加溶质分子之间的静电引力。水溶性有机溶剂本身的水合作用降低了自由基的浓度，压缩了溶质分子表面原始水合层的厚度，使溶质分子脱水凝聚。5.2.2影响沉淀效果的因素，温度有机溶剂和水混合时释放了相当数量的热量，提高了系统温度，增加了有机溶剂对蛋白质变性的影响。

9、PH的很多蛋白质在等电点附近有较好的沉淀效果。有机溶剂的种类和数量、无机盐离子的存在往往有利于沉淀作用，甚至保护蛋白质，防止变性，减少水和溶剂的相互溶解，稳定介质PH作用。无机盐含量、有机物的性质：沸点、毒性、挥发性、对生物分子的影响综合因素。，某些金属离子的沉淀作用，多价阳离子(例如Ca2，Zn2)。与蛋白质结合形成复合物，可以大大降低蛋白质的溶解度，因此可以更充分地沉淀，在减少有机溶剂用量的情况下，使用锌盐时，溶液中不要含有磷酸根离子。为了避免沉淀，常用的锌盐是醋酸锌或硫酸锌。实际操作时，通常先放入龙刺去除杂蛋白，然后再添加Zn2沉淀目的物。例如，在胰岛素精制过程中，首先调节pH4.2，然

10、后加入丙酮去除杂蛋白，然后升高PH6.0，添加乙酸锌，胰岛素锌沉淀。样品浓度，样品稀时增加溶剂投磷量和损失，降低溶质收率，易产生稀释变性，但共针作用小，分离效果好。相反，深色样品会增加共沉淀作用，降低分辨率，但减少溶剂用量，提高回收率，变性风险也小于稀释溶液。一般蛋白质的初始浓度为0.59612%，点多糖112为宜。5.3其他沉淀法除了盐析沉淀法和有机溶剂沉淀法外，还常用等电点沉淀法、圣盐沉淀法、亲和沉淀法、高分子聚合物和表面活性剂沉淀等。5.3.1等电点沉淀法利用蛋白质在等电点等溶液中溶解下降的原理对沉淀分级的方法称为等电点沉淀法。原理溶液pH值为蛋白质的等电点时，分子表面的纯电荷为零，蛋白

11、质表面的双电层和水合膜被削弱或破坏，分子间引力增加，溶解度降低。5.3.2成盐沉积法，生物大分子和小分子都可以产生盐类复合物沉淀，牙齿方法一般分为能与生物分子的酸性功能团起作用的金属复合盐法，如铜盐、银盐、锌盐、铅盐、锂盐、钙盐等。与生物分子的碱性功能团起作用的有机酸复合盐法，如苦味酸盐、苦酮酸盐、单宁酸盐等；无机复合盐法(例如磷钨酸盐、磷钼酸盐等)。上述盐类复合物都具有很低的溶解度，很容易沉淀，沉淀成金属复合盐后，可以通过长龙S将金属变成硫化物并去除。对于有机酸、磷钨酸盐，添加无机酸，萃取为尿素，从人醚中去除有机酸、磷钨酸等，或用离子交换法去除。重金属、部分有机酸、无机酸和蛋白质形成复合盐后

12、，蛋白质经常发生不可逆转的沉淀，应用时要慎重。5.3.2.1金属离子沉淀，核酸、蛋白质、多肽、抗生素、有机酸等许多生物活性物质形成金属离子和不溶性复合物沉淀。根据它们和物质作用的机制，金属离子可以分为三个茄子主要类别。第一个是Mn2，Fe2，Co2，Ni2，Cu2，Zn2，CD2第二类是可以与羧基结合但不能与氮化合物结合的金属离子(例如Ca2、Ba2、Mg2、Pb2等)。第三类是可以与巯基结合的金属离子，例如Hg2、Ag2、Pb2。分离沉淀物后，要分解复合物，使用离子交换法或金属合剂EDTA等去除金属离子。5.3.2.2有机酸类复合盐沉淀，氮有机酸(如苦味酸、苦酮酸、单宁酸等)形成有机分子的碱

13、性功能团和复合物沉淀。但是，牙齿有机酸和蛋白质形成盐复合物沉淀时，经常发生不可逆转的沉淀反应。应用工业上的牙齿方法准备蛋白质时，应采取比较温和的条件，有时还应加入一定的稳定剂，防止蛋白质变性。5.3.3亲和沉淀法，在一定条件下，利用亲和反应原理，结合配合器和可溶性载体，形成载体一倍复合物(亲和沉淀剂)，牙齿复合物可选择性地与蛋白质结合沉淀。排气包括酶的基质、抑制剂、辅酶、免疫排气、有机染料等。在中性pH中溶解，但在低声音中沉淀，例如Sehneider等N-丙烯腈、丙烯胺、N-丙烯酸-氨基苯甲酸为聚合物。氮基苯可用作橡胶酶的亲和配合，在配合剂和酶的亲和力后，将pH降低到4.0会产生沉淀，将pH降

14、低到2.0会解除沉淀。5.3.4聚合物沉淀法可用于选择性沉淀许多水溶性非离子型聚合物，尤其是PEG，以纯化蛋白质。认为原理聚合物的作用类似于有机溶剂，可以降低水合度，沉淀蛋白质。牙齿现象与两位首相的形成有关。要沉淀低分子量的蛋白质，需要放大量的PEG。沉淀聚合物的蛋白质，添加量小。PEG是特别有用的沉淀剂。因为无毒，不连续性，对大部分蛋白质都有保护作用。PEG沉淀法可以在室温下进行，得到的沉淀颗粒大，易于收集。佩格的分子量必须大于4000，最常用的是6000和20 000。使用的PEG浓度一般为20，浓度高会增加粘度，使沉淀物回收更加困难。无需移除PEG，因为其对后续分离阶段的影响较小。但是它

15、的存在用A280和Lowry方法测定蛋白质，但不妨碍biuret法。5.3.5表面活性剂沉积法、16烷基三甲基溴(CTAB)、16烷基氯化吡啶(CPC)、12烷基硫酸钠(SDS)等都属于离子型表面活性剂。CTAB，CPC用于沉淀酸性多糖，SDS常用于分离胰腺或核蛋白。十六烷基三甲基溴和十六烷基氯吡啶等阳离子表面活性剂是分离点多糖的有效沉淀剂。CTAB分子CH31(CH2)141 CH214N(CH3)3Br-牙齿配合物在低离子强度的水溶液中不溶解，但在溶液离子强度增加到一定范围后逐渐溶解，最终溶解。沉淀效果也与溶液的pH相关。CUB的沉淀效果很强，可以在非常稀有的溶液(如万分之一浓度)中通过选

16、择性沉淀回收点多糖。5.4结晶，结晶是制备纯物质的有效方法。在一定条件下，溶液中的溶质由于分子的有序排列而结合成晶体。晶体的化学成分均匀，具有多种对称的晶体，其特点是离子和分子在空间晶格的结合点有规则的方面。一般来说，只有相同种类的分子或离子才能排列成晶体，因此结晶过程是很选择性的。通过结晶，溶液中的大部分杂质留在母液中过滤和洗涤，就能得到纯度高的晶体。5.4.1结晶过程，结晶是指溶质在过饱和溶液中自动析出和折叠的过程。当溶液浓度等于溶质溶解时，牙齿溶液称为饱和溶液，溶质不能在饱和溶液中析出。溶质浓度超过溶解度时，牙齿溶液称为过饱和溶液。溶质只能在过饱和溶液中析出，过饱和度是决定的推动力。形成

17、新的表面(固相)需要一定的表面自由能。为了形成新的表面，必须对表面张力进行工作，因为溶质浓度达到饱和浓度时不能析出晶体。浓度超过饱和浓度达到一定的超饱和度时，可以析出晶体。因此，结晶包括过饱和溶液形成的三个茄子过程。结晶核形成；晶体生长。5.4.2过饱和溶液的形成，5.4.2.1蒸发法蒸发法是通过蒸发去除部分溶剂的结晶方法，在大气压或减压下通过加热蒸发去除部分溶剂，达到或保持溶液的过饱和度。牙齿方法适用于溶解度随温度变化而变化不大的物质或随温度上升而下降的物质，物质需要一定的热稳定性。蒸发法常用于某些小分子化合物的结晶，但容易变质的蛋白质或脆性物质应渡边杏采用。丝裂酶(mitamycin)在氧化铝吸附柱上冲洗的甲醇，三氯化甲烷溶液在真空浓缩中去除大部分溶剂后，可以获得丝裂霉素的晶体。灰霉素的丙酮提取液在真空浓缩蒸发大部分丙酮后，灰霉素晶体析出。，5.4.2.2温度诱导法，蛋白质酶抗生素等生化物质的溶解度大部分受温度的影响。先做溶液，