3基因工程的酶学基础5.ppt

1、第二节 基因工程的工具酶 Enzymes for Molecular Cloning,工具酶（instrumental enzyme of gene enginering）是应用于基因工程的各种酶的总称。 基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。 到目前为止，常用的工具酶有300多种。,工具酶,常用的工具酶：,一、限制性核酸内切酶及DNA分子的体外切割 二、连接酶及DNA分子的体外连接 三、DNA聚合酶,（1）定义 (restriction endonuclease），这类酶又称为限制性内切酶

2、或限制酶 。 是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核苷酸内切酶，结果产生具有3羟基和5磷酸基团的片断。,1. 限制性核酸内切酶,限制性内切酶是基因工程中不可缺少的工具酶，有人称之为“基因工程的手术刀”。 限制性内切酶切点专一，它作用于DNA分子，产生特异的DNA片段。,一把特殊的剪刀限制性内切酶的发现阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖,细菌的限制修饰作用,1952年，Luria和Human， 1953年，Bertani和Weigle 发现细菌的限制（restriction）现象：,Ph

3、age（k）,E.coli k,E .coli B【E .coli B 限制 （k）】,感染,不感染,限制性核酸内切酶的发现,噬菌体侵染细菌,l,E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶,当(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。 而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。 EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。,仍有少量phage (K)可在 E. coli B中生存，是因为E.coli B phage对 (K

4、)进行了修饰。,大肠杆菌B,大肠杆菌K,修饰的phage (B),修饰的phage (K),10-4（限制作用）,10-4（限制作用）,1（修饰作用）,R-M系统,细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，构成了寄主控制的限制修饰系统(R-M Restriction-modification system)。 R-M系统是细菌安内御外的积极措施。细菌R-M系统的限制酶可以降解DNA，为避免自身DNA的降解，细菌可以修饰（甲基化酶）自身DNA，未被修饰的外来DNA则会被降解。 个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降解。,限制性核酸内切酶的发现,1968 Linn和Arber从E.c

5、oli B中发现限制酶 1970 Smith（美）在流感嗜血杆菌发现限制酶 1978 W. Arber，H. O.Smith，Nathans因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖金,限制性核酸内切酶（限制酶）：在细胞内能够识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并对DNA分子进行切割的一种酶。 功能：降解不同源DNA，而不降解同源DNA。,（2）分类,根据酶的功能、大小和反应条件，及切割的特点，可以将限制性内切酶分为三类： 型酶、型酶、 型酶,1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分离出的核酸内切酶。 分子量较大，反应需Mg+、S-腺苷酰

6、-L-甲硫氨酸（SAM）、ATP等。 切割DNA的方式是：先与双链DNA上未加修饰的识别序列相互作用，然后沿着DNA分子移动，在行进相当于10005000个核苷酸的距离之后在随机位置上切割单链DNA。 这类酶有特异的识别位点但没有特异的切割位点，而且切割是随机的，所以在基因工程中应用不大。,型酶,型酶,1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox在流感嗜血Rd株中分离出来的限制酶。 分子量较小（105Da），只有一种多肽，通常以同源二聚体的形式存在。反应只需Mg+的存在，并且具有以下两个特点，使这类酶在基因工程研究中，得到广泛的应用。 识别位点是一个回文对称结构，并且切割位点也在这一回

7、文对称结构上。 许多型酶切割后，可在上形成粘性末端，有利于片段的重组。基因工程技术中常用型,型酶,这类酶可识别特定碱基顺序，并在这一顺序的3端2426bp处切开，所以它的切割位点也是没有特异性的。,（3） 型酶的基本特性,DNA双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子，产生链的断裂。 两个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的 断裂的结果形成的DNA片断，也往往具有互补的单链延伸末端。,限制性核酸内切酶的类型,第一个字母：大写，表示所来自的微生物的属名的第一个字母。 第二、三字母：小写，表示所来自的微生物种名的第一、二个字母。 其它字母：大写或小写，表示所来自的微生物的菌株号

8、。 罗马数字：表示该菌株发现的限制酶的编号。 例：EcoR I: 来自于Escheria coli RY13的第一个限制酶。,限制性核酸内切酶的命名原则：,限制性核酸内切酶的活性单位,50L Buffer中，含1g底物DNA，于最适反应条件和温度下，保温1小时，能使1g DNA完全降解所需的酶蛋白量即为一个酶单位，用U表示。 buffer （pH=8.0） ： 50mmol/L Tris-HCl 10mmol/L MgCl2 1mmol/L DTT或巯基乙醇 100g BSA/ml （DDT：二硫苏糖醇 BSA：牛血清蛋白),2. DNA的体外切割,（1）限制性核酸酶的识别序列 （2）限制性核

9、酸内切酶的酶切位点 （3）限制性核酸内切酶酶切DNA的方法,（1）限制性核酸酶的识别序列,识别序列： 限制性核酸内切酶在双链DNA上能够识别的48个核苷酸组成的序列，因限制酶是从其识别序列内切割DNA分子，故识别序列又称限制酶的切割位点，亦称靶子序列。,（1）限制性核酸酶的识别序列,回文结构(palindrome) 无论限制酶的识别序列是连续的（如GATC）还是间断的（GANTC），其共同点是识别序列均具有双重旋转对称的结构形式，换言之，这些核苷酸对的顺序是呈现回文结构，有的也称为旋转对称或左右互补对称。序列被正读和反读是一样的。,EcoR ：,Pst：,不同核酸内切酶的特异识别位点,DNA,

10、Hind,Hind切割位点,核酸内切酶Hind对双链DNA分子的切割作用,限制酶（型）识别及切割位点 特异识别及切割48个bp长度且具有回文序列的DNA片断，主要产生3种末端结构： 5粘性末端 3粘性末端 平端或钝端 平齐末端:有些限制性内切酶在同一位点平齐切割DNA两条链，而形成两端平整的DNA分子. 粘性末端(sticky end)是指经内切酶特异切割后产生的5末端突出和3末端突出的碱基序列相互间具有互补性。,三种酶切末端,平齐末端（如Sma、Alu、Hae）,5粘性末端（如EcoR ）,5-G- -AATTC-3,3-CTTAA- -G-5,3粘性末端（如Pst ）,同裂酶与同尾酶,同裂

11、酶（isoschizomers) ： 指来源不同但识别相同靶序列的核酸内切酶。同裂酶进行同样的切割，产生同样的末端。但有些同裂酶对甲基化位点的敏感性不同。 Example: 限制酶Hpa和Msp是一对同裂酶，相同的靶序列是CCGG ，当靶序列中一个5-甲基胞嘧啶时Hpa不能进行切割，而Msp可以。,在切割DNA时，其切割点可以是相同的，产生平头末端，称为同识同切； 切割点也可以是不同的，产生3或5粘性末端，称为同识异切。,同裂酶与同尾酶,同裂酶同识同切,同裂酶同识异切,同裂酶与同尾酶,对于同裂酶可以具有不同的酶切位点，也可以具有相同的酶切位点。 前者肯定是两种不同的限制酶，而后者往往是从不同生

12、物体中提取到的同一种限制酶。,同尾酶（isocaudamer）：指来源不同、识别靶序列不同，但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。 杂种位点（hybrid site）：由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。 这种杂种位点的结构一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。,同裂酶与同尾酶,BamH Bcl Bgl三种酶可产生相同的5GATC粘性末端，由这种同尾酶产生的DNA片段可因粘性末端的互补而彼此再连接起来。,同裂酶与同尾酶,（2）限制性核酸内切酶的酶切位点,酶切位点 粘性末端 平（齐）末端,酶切位点,DNA在限制酶的作用下，使多聚核苷酸链上磷酸二酯键断

13、开的位置称为酶切位点，以表示，酶切位点多数位于识别序列的内部，但也有少数的酶切位点在识别序列的两侧。 如G GATTC、CGGC GG、 GATC、GATG 等。,粘性末端,两条链上的断裂位置是交错地、但又是围绕着一个对称结构中心，这样形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片断。 所产生的DNA片断末端的一条链多出112个核苷酸，这样的末端称为粘性末端，能够重新环化。,平末端,两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片断。不易重新环化。,（3）限制酶酶切DNA的方法,单酶切法 双酶切法 部分酶切法,环状DNA：？ 线形DNA：？,二.DNA连接酶与DNA

14、分子的体外连接,1. DNA片断的体外连接方法 2. DNA连接酶 3. DNA片断之间的连接 4. 热稳定的DNA连接酶,重组DNA技术相关概念,克隆(clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。,获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。,DNA克隆,技术水平：分子克隆(molecular clone) 即DNA 克隆 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）,DNA克隆 基因克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主

15、细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称或重组DNA (recombinant DNA) 。,1. DNA片断的体外连接方法,用DNA连接酶连接有互补粘性末端的DNA片断。 用T DNA连接酶将平末端的DNA片断连接；或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片断加上poly(A)- poly(T)尾巴之后，再用DNA连接酶连接。 先在DNA片断末端加上化学合成的衔接物或接头，形成粘性末端后，再用DNA连接酶连接。,2. DNA连接酶(DNA ligase),（1）概念： 能够催化DNA链上彼此相邻的3-羟基（ OH ）和5-磷酸基团（-P），在NAD

16、+或ATP供能的作用下，形成磷酸二酯键，从而使两末端连接的酶。 只能连接缺口（nick），不能连接裂口（gap）。而且被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分。,需能反应：,在大肠杆菌和细菌中，DNA ligase催化的连接反应是利用NAD+作为能源的； 在动物和噬菌体中，DNA ligase催化的连接反应是利用ATP作为能源的。,缺口nick和裂口gap,缺口nick：即在双链DNA的某一条链上两个相邻的核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂，该断裂能为DNA ligase所连接。 裂口gap：即在双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链断裂，该断裂不能为DNA l

17、igase所连接。,常用DNA ligase 来源,由大肠杆菌染色体编码的叫DNA连接酶，即E.coli DNA ligase，以NAD+为辅因子由大肠杆菌T4噬菌体编码的叫T4 DNA连接酶，以ATP为辅因子 基因工程中常用的连接酶主要有：T4DNA连接酶和大肠杆菌连接酶，而以前者为最常用。,AATTC G,G CTTAA,AATTC G,G CTTAA,5,5,5,5,(1) (2),AATTC G,G CTTAA,AATTC G,G CTTAA,5,5,5,5,(a)分子间连接,(b)分子内连接,(1) (2),AT,G,C,T,A,TA,G,C,T,A,T4连接酶,T4连接酶,影响连接

18、酶作用的因素,反应温度： 连接缺口的温度：37度；连接粘性末端的最佳温度： 415度 4 DNA连接酶的用量： 平末端DNA分子的连接反应中，最适12个单位。 粘性末端DNA片断之间的连接，酶浓度0.1个单位。 ATP的用量10mol1mmol/L之间 提高外源片断与载体的浓度的比值，（1020倍）,3. DNA片断之间的连接,（1）具有互补粘性末端片断之间的连接 （2）平（齐）末端片断之间的连接,（1）具有互补粘性末端片断之间的连接,该连接可用E.coli DNA ligase，也可用T4 DNA连接酶。 如果待连接的DNA片断的末端是用同一限制酶酶切所得，则连接后仍保留原限制酶的识别序列，

19、如果是用两种限制酶酶切所得，则重组DNA分子往往会失去原限制酶的识别序列，,（1）具有互补粘性末端片断之间的连接,具粘性末端的载体易发生自连（防止方法）： 对载体的5末端进行处理，用细菌的或小牛肠的碱性磷酸酶移去磷酸基团，使载体不能自连。 而外源片断的5-P能与载体的3-OH进行共价键的连接。这样形成的杂种分子中，每一个连接位点中载体DNA只有一条链与外源片断相连，失去5-P的链不能进行连接，形成3- OH 和5- OH 的缺口。但这样的DNA分子仍可以导入细菌细胞，并在宿主细胞内完成缺口的修复工作。,碱性磷酸酯酶,碱性磷酸酯酶：是催化从单链或双链DNA和RNA分子中除去5磷酸基，即脱磷酸作用

20、。,在基因工程中得到广泛使用的有两种： 一种是BAP：从大肠杆菌中提取的 另一种是CIP：从牛小肠提取的。 两种酶反应均需要Zn2+。由于BAP耐热，而CIP在70加热10分钟或经酚抽提则失活；CIP的特异活性较BAP高10-20倍，因此，CIP应用更广泛。,主要用途：,去除DNA和RNA的5磷酸基，产生5羟基末端，然后在T4多聚核苷酸激酶催化下，用-32PATP进行末端标记，继而进行序列分析； 去除载体DNA两末端的5磷酸基，防止载体DNA自我环化，提高DNA重组率。,（2）平（齐）末端片断之间的连接,只能用T4 DNA连接酶 如果用两种不同的限制酶酶切所产生的平末端进行连接，则连接后的DN

21、A分子会失去原来那两种酶的识别序列； 如两片断的末端是用同一限制酶酶切产生，则连接后的DNA分子仍保留原限制酶的识别序列，有的还会出现新的限制酶的识别序列。,（2）平（齐）末端片断之间的连接,连接平末端DNA的方法除直接利用T4 DNA ligase外，还可以用末端核苷酸转移酶给平末端加上同聚物尾巴之后，再用DNA连接酶连接。 常用的连接方法：同聚物加尾法、衔接物法和接头连接法,末端转移酶,催化脱氧核苷酸添加到DNA分子的3-OH末端上 催化作用不要求有模板，但需有Co2+的存在。 末端转移酶可给一些DNA分子的3-OH末端接上寡dA或dG；另一些DNA分子的3-OH末端接上寡dT或dC，混合

22、这些分子，即可使同聚物尾部退火形成环状分子。 主要用途：,末端 （脱氧核苷酸）转移酶(TdT),用途 探针标记,P32-.dGTP,G32G32G32G32,G32G32G32G32, 在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接,3,3,同聚物加尾法,该法的核心部分是利用末端脱氧核苷酸转移酶转移核苷酸的特殊功能，即将核苷酸加到DNA分子单链延伸末端的3-OH基团上，即不需模板链进行核苷酸的连接。 同聚物尾巴有poly（dA）与 poly（dT）、 poly（dC）与poly（dG）。,同聚物加尾法,用5 末端特异的核酸外切酶处理DNA片断,在A和B分别中加入dATP和dTTP,同聚物尾

23、巴1040个碱基,衔接物连接法,平末端的另一种处理方式是利用衔接物（linker）进行处理，人工加上粘性末端。衔接物是一种人工合成的小分子DNA，约1020个核苷酸，其结构特征是含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点的回文结构。 将衔接物分子与平末端DNA分子连接，再用限制性核酸内切酶酶切，便可产生粘性末端。 这种方法的优点是克隆位点具有限制酶的酶切位点。,双衔接物连接法的基本程序,cDNA链的合成,通过DNA聚合酶合成第二链,加入Sal I衔接物,S I核酸酶作用后的末端单链突出序列， 由Klenow补齐，加入第二衔接物Ecol I,双衔接物：可以实现定向克隆，防止发生自连，同时对克隆片断的再删

24、除也比较方便。,DNA接头（adapter）连接法,DNA接头（adapter）：它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片断。 粘性末端容易通过碱基配对形成如同衔接物一样的二聚体分子。对DNA接头分子末端，进行必要的修饰。移走粘性末端5-P，暴露出5-OH，不能产生稳定的二聚体分子。,4.热稳定的连接酶,热稳定的DNA连接酶从嗜热高温放线菌的菌株中分离出来的，能在高温（8594）下催化两条寡核苷酸探针发生连接用的一种核酸酶。 （1）寡核苷酸连接测定（OLA）：用两个寡核苷酸探针，同已知序列的靶DNA杂交，探针在靶 DNA分子的位置是相邻的。 （2）连

25、接酶链式反应（LCR）：也叫连接扩增反应，用寡核苷酸探针通过DNA连接酶的作用扩增已知序列的靶DNA的方法。需要4种引物，,寡核苷酸连接测定 AGTGACCT TCACTGGA A G T G A C C T A G T T A C C T T C A C T G G A T C A C T G G A A G T G A C C T A C C T A G T G A C C T A C C T,待扩增的DNA片断,P,P,B,B,D,D,地高辛配基,生物素,磷酸,B,B,B,B,D,D,P,P,阳性信号,无信号,酶抗生素蛋白,由于碱基错配不能形成磷酸二酯键,检测单碱基的取代、插入、及缺失而

26、引起的多态性,LCR：ligase chain reaction，连接酶链式反应。,样品DNA、探针(4) 94度变性,三.DNA聚合酶,DNA聚合酶 分子生物学中常用的DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶,1.DNA聚合酶(DNApolymerase),DNA聚合酶:指在DNA(或RNA)模板指导下，以4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）为底物，在引物3 -OH末端聚合DNA链的一类酶。 是DNA合成过程中必须具备的酶，能催化DNA的合成及DNA合成过程中的修饰反应，以保证DNA的复制及复制过程中DNA的相对稳定性，尽可能防止碱基突变的发生。,需模板(DNA或RNA)； 需引物； 具有三种酶活性，即

27、53聚合酶活性；53外切酶活性和35外切外切酶活性。,DNA聚合酶（DNApolymerase）,DNA聚合酶的特点：,分子生物学中常用的DNA聚合酶,常用的有：大肠杆菌DNA聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow大片断酶、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、反转录酶、Taq 酶及高保真的pfu酶等。 共同点：把脱氧核糖核苷酸连续的加到双链DNA分子引物链的3-OH末端，催化核苷酸的聚合作用，而不发生从引物模板上解离的情况。,大肠杆菌DNA聚合酶,DNA聚合酶（Pol）、DNA聚合酶（Pol ）、DNA聚合酶 （Pol ） Pol和Pol 的主要功能参与DNA的合成； Pol 的功能同

28、DNA的复制有关； Pol同DNA分子克隆的关系最为密切。,大肠杆菌DNA聚合酶,1957年，美国的生物学家在大肠杆菌提取物中存在DNA聚合酶，即现在所说的DNA聚合酶(全酶)。 DNA聚合酶，可以被蛋白酶切割成两个片断，一个具有全部的3 5的外切酶活性和5 3 的聚合酶活性，另一个具有全部5 3的外切酶活性。,DNA聚合酶的酶活性,5 3的聚合酶活性； 5 3的外切酶活性； 3 5的外切酶活性（较低）。,DNA聚合酶发挥作用的条件,底物： 四种脱氧核苷5-三磷酸（dNTP）； Mg+离子； 带有3-OH游离基团的引物链； DNA模板：单链，双链（糖-磷酸主键上有一个或多个断裂）。,1） 53

29、聚合酶活性：,2）53外切酶活性,3）35外切酶活性,DNA聚合酶的三种活性,DNA pol的53聚合活性和53外切酶活性协同作用，可以使DNA一条链上的切口从53方向移动，这种反应叫做缺刻平移(nick translation)。 利用此反应可在体外对DNA片段进行放射性磷(-32PdNTP)的标记制成探针(probe)，进行核酸的分子杂交实验，是现代分子生物学的一项重要技术(见下图)。,DNA聚合酶在DNA复制过程中的作用,DNA聚合酶在DNA复制过程中的作用,DNA的切口平移（nick translation）,DNA聚合酶在分子克隆中的主要用途是通过DNA缺口平移，制备供核酸分子杂交用

30、的带放射性标记的DNA探针。,5-3外切酶活性,5-3聚合酶活性,未经标记的核苷酸,经标记的核苷酸,DNA杂交探针的制备,5 3,3 5,5 3,3 5,*,*,*,*,*,*,*,(a),(b),(c),(d),(e),(a)双链的DNA分子,(b)带有3-OH末端的单链缺口,(c) pol从5-P移去一个核苷酸,(d) pol将32P标记的核苷酸参入取代被移去的核苷酸,(e)重复(c)(d)的步骤，缺口沿5-3方向移动，形成32P标记的核苷酸合成的DNA链,探针（probe）,探针：用来探知被测物存在的小DNA或RNA叫做探针。 标记物：探针上结合有易被检测的化合物称为标记物。 分子杂交：

31、探针DNA或RNA与被测物的互补结合叫做分子杂交（molecular hybridization）,DNA聚合酶和的比较,DNA聚合酶,来源 E.coli，由染色体DNA基因编码。商品上用的此酶来源于Phage NM964整合的溶源性E.coli。 结构 一条多肽链，MW = 109，000 D。 活性 5 3聚合，3 5和 53外切。,Klenow,来源： E.coli DNA Polymerase经蛋白酶水解的大片段(Klenow和Henningseon.1970),DNApol,枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶,C端(76kd) + N端（36kd）,5 3外切,Klenow 5 3聚合 3 5

32、外切,Klenow,用途 填补限制酶的5-粘性末端为平齐末端,5CC 3GGAATT,5CCTTAA3 3GGAATT5,Klenow,3-末端标记：Klenow 在无底物时只进行3 5外切；有底物存在时则聚合。 这种标记也称作交换标记，但Klenow作用不如T4DNA聚合酶。,T4DNA聚合酶,来源：T4Phage感染的E.coli 结构：MW=114，000d 活性： 53聚合活性； 35外切活性，对单链活性大于双链DNA，外切酶活性比Klenow大200倍 用途 填补或标记限制酶切后产生的5-粘性末端的3-凹缺末端。（同Klenow） 3-粘性末端的标记制备DNA探针,同 Klenow

33、末端标记。 ,T7DNA聚合酶（测序酶）,来源：T7Phage感染的E.coli 结构：由2个蛋白亚基组成： T7phage gene5蛋白 + 宿主硫氧蛋白 活性： 53聚合，持续反应时间最长，所以合成的DNA链长。故在DNA测序中很优越。 35外切，是DNA 聚合酶的 1000倍。,用途 复制较长的模板，在测序中可读出较长的序列 用填补或交换反应快速进行末端标记。 与TDNApol一样，平齐粘性末端。 定点突变中互补链的合成。,修饰的 T7DNA 聚合酶(测序酶),来源： 天然 TDNA聚合酶经修饰处理 结构：同T聚合酶。 用还原剂、分子氧、低浓度 Fe+与酶保温几天，可使PhageT7 g